检本PCR技术及其应用课件.ppt

1、PCR及其相关技术及其相关技术 第一节第一节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应WWW.YOUR-COMPANY-URL.COMPCR聚合酶链反应（聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction)是一种利用是一种利用DNA聚合酶聚合酶在体外在体外使使特定的特定的DNA片段片段进行大量快速合进行大量快速合成的技术成的技术,可以将微量目的可以将微量目的DNA片段片段扩增一百万倍以上扩增一百万倍以上。WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM复制复制子代子代DNA 知识回顾知识回顾DNA的复制的复制 (replication)细胞内细胞内亲代亲代DNA合成两个相同的子代合成两个相同

2、的子代DNA的过程。的过程。亲代亲代DNAATGCATTACGTA5335ATGCATTACGTA53ATGCATTACGTA35WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM1.在体外如何使模板在体外如何使模板DNA的双链解开，提的双链解开，提供单链做为模板呢？供单链做为模板呢？2.在体外如何使引物与模板结合，以催化在体外如何使引物与模板结合，以催化新的子链的不断延伸？新的子链的不断延伸？一、一、PCR的反应过程的反应过程WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM变性变性94-97C延伸延伸72C退火退火40-70C一、一、PCR的反应过程的反应过程加热使双链加热使双链DNA变为单链

3、变为单链降温使引降温使引物和互补物和互补模板在局模板在局部形成杂部形成杂交链交链 耐热耐热DNA聚合聚合酶按酶按53方向方向催化以引物为起催化以引物为起始点的延伸反应始点的延伸反应WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM参与参与PCR反应的主要成份反应的主要成份:1.模板模板 Template2.引物引物 Primers3.脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸 dNTP4.DNA聚合酶聚合酶 DNA polymerase5.缓冲液缓冲液 Buffer6.其它物质其它物质二、二、PCR的反应体系的反应体系WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM 2)模板类型模板类型：可以是：可以是DNA

4、，也可以是，也可以是RNA 3)模板来源模板来源：基因组：基因组DNA，质粒或线粒体，质粒或线粒体DNA 病毒病毒RNA等等 模模 板板 Template 1)PCR模板模板：将要被复制的核酸片段：将要被复制的核酸片段 4)模板要求模板要求：对纯度要求严格，用量很低：对纯度要求严格，用量很低 （二、二、PCR的反应体系的反应体系WWW.YOUR-COMPANY-URL.COMTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATG

5、TAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTACGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaq PolymeraseTaq PolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA3553Sense primerAntisense primer引引 物物 Primers二、二、PCR的反应体系的反应体系WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM引

6、物的重要性：引物的重要性：能与模板特异地结合能与模板特异地结合 引物决定产物的长度引物决定产物的长度 引物决定产物的特异性引物决定产物的特异性 引物设计时必须遵循一些原则引物设计时必须遵循一些原则 二、二、PCR的反应体系的反应体系WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM引物设计的原则引物设计的原则1、2条（上、下游），分别与模板的条（上、下游），分别与模板的2条条 链的链的互补互补2、引物的长度一般为、引物的长度一般为1825个核苷酸个核苷酸3、5AGCCATGA33GTACTCAG55AGCCATGA33GTACTCAG5引物二聚体引物二聚体二、二、PCR的反应体系的反应体系WWW

7、.YOUR-COMPANY-URL.COM引物设计的原则引物设计的原则4、引物碱基组成平衡、引物碱基组成平衡5、引物退火温度计算、引物退火温度计算 Tm=2（A+T）+4（C+G）两条引物的两条引物的Tm要接近，并决定退火稳定要接近，并决定退火稳定二、二、PCR的反应体系的反应体系WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM引物设计的原则引物设计的原则6、引物的、引物的5 端加适当的修饰成分（引入酶切端加适当的修饰成分（引入酶切位点、引入突变位点等）位点、引入突变位点等）7、3端碱基一定要与模板端碱基一定要与模板DNA严格配对严格配对 引物浓度：引物浓度：0.1 0.2 mol/L,浓度过

8、高容易生成引物二聚体浓度过高容易生成引物二聚体二、二、PCR的反应体系的反应体系WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM引物设计软件引物设计软件 VectorNTI Primer 5.0 Oligo The Primer Generator NetPrimer Primer Premier 4.10 http:/cbr-rbc.nrc-cnrc.ca/cgi-bin/primer3www.cgi;http:/genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer;http:/bioinformatics.weizmann.ac.il/cgi-bi

9、n/primer/primer3.cgi;http:/itsa.ucsf.edu/urolab/methprimer/index1.html;http:/alces.med.umn.edu/rawprimer.htmlWWW.YOUR-COMPANY-URL.COM脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸 dNTP dATP、dCTP、dGTP和和dTTP的混合物的混合物 反应体系中反应体系中4种核苷酸的种核苷酸的摩尔浓度摩尔浓度必须一致必须一致 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加增也随之增加 最适浓度：最适浓度：20200mol/L二、二、PCR的反

10、应体系的反应体系WWW.YOUR-COMPANY-URL.COMDNA聚合酶聚合酶 DNA polymerase PCR发明的初期使用的发明的初期使用的DNA聚合酶是聚合酶是Klenow片段，对热的稳定性差。片段，对热的稳定性差。Taq DNA聚合酶聚合酶 从一种从一种水栖噬热菌（水栖噬热菌（Thermus aquaticus,Taq）中提取，有很高的耐热稳定性）中提取，有很高的耐热稳定性。二、二、PCR的反应体系的反应体系WWW.YOUR-COMPANY-URL.COMDNA聚合酶聚合酶 DNA polymeraseTaq DNA聚合酶的特点：聚合酶的特点：耐热耐热:在在75-80具有最高的

11、聚合酶活性具有最高的聚合酶活性模板：模板：DNA原料：原料：dNTP方向：方向：53无纠错无纠错功能：没有功能：没有35外切酶活性外切酶活性，错配率，错配率为为0.1%0.25%最适酶量：最适酶量：12.5UWWW.YOUR-COMPANY-URL.COM U A G C A|G C T T C A G G A T|3 A T C G T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性 A C|G C T G|较读功能较读功能 DNA聚合酶的核酸外切酶活性聚合酶的核酸外切酶活性 WWW.YOUR-COMPANY-URL

12、.COMDNA聚合酶聚合酶 DNA polymerase 耐热的高保真耐热的高保真 DNA聚合酶：聚合酶：Tth DNA polymerase Pfu DNA polymerase Vent DNA polymerase高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率二、二、PCR的反应体系的反应体系WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM缓冲液缓冲液 Buffer Tris-HCl:1050mmol/L 调节反应体系的调节反应体系的pH值，使值，使 DNA聚合酶的作用聚合酶的作用环境维持偏碱性环境维持偏碱性 KCl:50mmol/L 可促进引物退火，大于此

13、浓度将会抑制可促进引物退火，大于此浓度将会抑制DNA聚聚合酶的活性合酶的活性 Mg 2（Mgcl2）二、二、PCR的反应体系的反应体系WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM缓冲液缓冲液 BufferMg 2（Mgcl2）WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM标准的标准的PCR反应体系反应体系 模板模板DNA 50100ng 引物引物 0.10.2umol/L 4种种dNTP混合物混合物 20200umol/L 10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul Mg2+1.5mmol/L Taq DNA聚合酶聚合酶 12.5u 加蒸馏水至加蒸馏水至 100ul 二、二、PCR的反应体系的反

14、应体系WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM添加剂添加剂加入适量加入适量二甲基亚砜二甲基亚砜或甲酰胺或甲酰胺 破坏模板的二级结构破坏模板的二级结构，利于解链，利于解链加入加入BSA或或DTT 增加或改进增加或改进DNA聚合酶的稳定性。聚合酶的稳定性。其它物质其它物质二、二、PCR的反应体系的反应体系WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM变性变性94-97C延伸延伸72C退火退火40-70C三、三、PCR的反应条件的反应条件1、温度、温度2、时间、时间3、循环次数、循环次数WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM1.反应温度反应温度 变性温度：变性温度：9497 退火

15、温度：引物退火温度：引物Tm 5左右左右 温度过高：降低扩增效率温度过高：降低扩增效率 温度过低：增加非特异性扩增温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：延伸温度：72三、三、PCR的反应条件的反应条件 WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM2.反应时间反应时间 第一次变性应给予足够时间（第一次变性应给予足够时间（57分钟）分钟）每一个步骤所需时间每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长取决于扩增片段的长度度，一般为，一般为30s1min时间过长易导致非特时间过长易导致非特异性扩增异性扩增三、三、PCR的反应条件的反应条件 WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM3.循环次数循环次

16、数 三、三、PCR的反应条件的反应条件 No.of No.Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824一个分子的模板一个分子的模板经过经过30个循环，个循环，即可得即可得230(约约109)个拷贝产物个拷贝产物?WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM 实际反应中，实际反应中，DNA的每次复制都不完全，的每次复制都不完全，即每次扩增中模板并不是以即每次扩增中模板并不是以2 2n n倍增长。倍增长。实际为实际为:YX(1+E)n 三、三、PCR的反应条件的

17、反应条件 E=参与复制的模板参与复制的模板/总模板总模板 （扩增效率）（扩增效率）0GTG(Val)bA bA probe ACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC b bS probe ACTCCTGTGGAGAAGTCTGCCHeterobA bA probeb bS probeHomoNormal二、二、ASO技术技术WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM Reverse Dot Hybridization，RDH 如果同一种疾病有多种突变类型，则可将相应于如果同一种疾病有多种突变类型，则可将相应于各种突变的不同各种突变的不同ASO探针点膜，然后与标记的受检探针点膜，然后与标

18、记的受检DNA杂交，称为反向斑点印迹杂交杂交，称为反向斑点印迹杂交 probe 1 2 3 4二、二、ASO技术技术WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM三、单链构象多态性三、单链构象多态性 单链单链DNA分子具有特定的二级空间构象，取分子具有特定的二级空间构象，取决于该分子本身的碱基组成。突变决于该分子本身的碱基组成。突变DNA的的PCR产产物经变性后产生与正常物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条空间构象不同的两条单链在非变性单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构中时，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，从而能区象的单链片段具有不同的电泳迁移率，从

19、而能区别正常与突变的别正常与突变的DNA 不同顺序不同顺序 不同构象不同构象 不同电泳不同电泳行为行为Single-strand conformation polymorphism，SSCPWWW.YOUR-COMPANY-URL.COMPCRATCGWildWildAmplify region of interestDenature samples in Formamide and HeatATCGMutantMutantDNA molecules conformation depends on their sequenceRun on a Non-denaturing gel and lo

20、ok for mobility differencesTAGCWWW.YOUR-COMPANY-URL.COM三、单链构象多态性三、单链构象多态性 优点：优点：PCR-SSCP分析法适用于致病基因内尚未分析法适用于致病基因内尚未明确的点突变。明确的点突变。缺点：缺点：不能确定突变的位置和突变的性质。不能确定突变的位置和突变的性质。WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM四、熔点曲线分析四、熔点曲线分析 基于基于SYBR Green I 的荧光信号检测的荧光信号检测荧荧光光强强度度温度温度Tm值值WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM TmTm值的大小取决于值的大小取决于DNA

21、DNA分子的长度和其序列中分子的长度和其序列中G/CG/C碱基含量。碱基含量。当被检片段中存在突变时，就会有不同于野生序列当被检片段中存在突变时，就会有不同于野生序列片段的片段的TmTm值而呈现不同的波峰。值而呈现不同的波峰。如果一个被检片段中存在一个以上的突变时，可以如果一个被检片段中存在一个以上的突变时，可以出现一个以上的波峰，从而可以将突变序列检测出出现一个以上的波峰，从而可以将突变序列检测出来。来。四、熔点曲线分析四、熔点曲线分析 WWW.YOUR-COMPANY-URL.COMWWW.YOUR-COMPANY-URL.COM四、熔点曲线分析四、熔点曲线分析 优点：优点：PCR反应完成

22、后可直接进行分析，不需将反应完成后可直接进行分析，不需将产物取出进行电泳。产物取出进行电泳。耗时短、可同时大批量分析、耗时短、可同时大批量分析、重复性好。重复性好。WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM DNA序列测定是诊断基因突变最直接序列测定是诊断基因突变最直接可靠的方法。可靠的方法。五、五、PCR产物序列分析产物序列分析 WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM讨讨 论论：PCR的产物是：的产物是：A单一的目的片段单一的目的片段B与模板完全相同的与模板完全相同的DNA分子的拷贝占绝大多数分子的拷贝占绝大多数C两条引物间的特定两条引物间的特定DNA片段的拷贝占绝大多数片段

23、的拷贝占绝大多数 DB和和C各占一半各占一半PCR实验的特异性主要取决于：实验的特异性主要取决于：A反应体系中模板反应体系中模板DNA的量的量B引物的特异性引物的特异性C四种四种dNTP的浓度的浓度D循环周期的次数循环周期的次数WWW.YOUR-COMPANY-URL.COM小小 结结 1.PCR的反应过程、反应原理的反应过程、反应原理2.PCR的反应体系，引物设计原则，的反应体系，引物设计原则，PCR产物累产物累积的特点积的特点3.FQ-PCR的定量原理，的定量原理，CT值的概念，值的概念，CT值与值与模板初始量的关系模板初始量的关系4.PCR-RFLP,SSCP,熔点曲线分析检测熔点曲线分析检测PCR产物产物的基本原理的基本原理EGreat internet animations like these can be found on the Platinum Site.Search Bloodhound for networking!