酶学分析技术课件.ppt
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1、第七章第七章酶学分析技术酶学分析技术?本章内容概要:第一节第二节第三节第四节第五节酶活性测定的基本知识酶活性测定方法及酶学分析的类型同工酶测定酶学分析在临床诊断上的应用酶活性测定最适条件的选择?本章教学要求:1、掌握酶活性的国际单位定义,酶活性浓度的表示方法及酶活性单位的计算公式;酶活性测定的连续监测法和定时法的概念、区别和结果的计算方法;酶偶联反应的在酶活性测定和酶法分析代谢物中的应用;以NAD(P)H为指示系统和色素原底物在酶活性测定中的应用.2、熟悉酶促反应进程;酶促反应底物动力学;酶学分析在临床诊断上的应用。3、了解Km值、Vmax值的应用及Km和Vmax的测定;同工酶测定和酶活性测定
2、最适条件的选择。第一节第一节酶活性测定的基本知识酶活性测定的基本知识?酶活性的概念?酶活性单位?酶活性单位的计算?酶促反应进程?酶促反应底物动力学一、酶活性的概念内底物的减少量或产物的生成量。酶活性即酶促反应速度,指在规定条件下单位时间v=-dS/dt 或或 v=dP/dt。底物浓度为S,产物浓度为P,时间为t,反应速度为v注:在实际测定酶促反应速度时,以测定单位时间内产物的生成量为好。二、酶活性单位?定义:指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标准。?惯用单位:酶活性测定方法的建立者所规定的单位。?国际单位:1IU指在规定条件(最适pH,最适底物浓度)
3、下,每分钟转化1?mol底物的酶量。单位为IU/L。?Katal单位:1Katal指在规定条件下,每秒钟转化1mol底物的酶量,1Katal=60106IU。三、酶活性单位的计算步骤:明确测定方法的定义确定物质量、体积和时间的单位,酶单位定义,按照酶单位运用公式进行计算。?计算公式:产物的增加量每单位规定的保温时间1000(ml)酶单位/升=每单位规定的产物增加量实际保温时间实际标本用量(ml)分光光度法测定的公式:酶单位/升=?LV标标实际保温时间(A测定 A对照)对照)V总总106每单位规定的保温时间四、酶促反应进程?酶促反应进程曲线?酶量的测定:测定酶量,应使酶浓度(通过酶活性测定间接测
4、得酶的含量,因此,要准确正比,即能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速E-dS/dtE)与酶促反应速度成或EdP/dt。度,即酶促反应初速度。速度才能准确代表酶活性。酶活性测定时首先要确定线性期,在此期测定反应酶促反应初速度酶活性酶的含量五、酶促反应底物动力学?中间产物学说:酶促反应进行时,酶首先与底物结合为中间产物,然后再催化底物反应生成产物。E+S?ES E+P?米-曼氏方程:VmaxSv=S+Km上式中S代表底物浓度,v代表反应速度,Km称为米氏常数。Vmax代表最大反应速度,(一)米氏常数的定义由米-曼氏方程可以导出:(Vmax-v)SKm=v当v=1/2Vmax时,Km=S。因
5、此Km值为反应速度相当于最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数,具有重要的应用价值。(二)Km值的应用1.鉴定酶的种类Km值是酶的特征常数,在反应条件一定时,只与酶的种类和底物的性质有关,与酶的浓度无关。不同种类的酶其Km值不同,对于一种未知的酶,可在规定的条件下测定其Km值加以鉴定。表7-1 某些酶的Km值酶酶底物底物Km(mmol/L)乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶丙酮酸丙酮酸0.017己糖激酶己糖激酶D-葡萄糖葡萄糖0.05D-果糖果糖1.5?-半乳糖苷酶半乳糖苷酶D-乳糖乳糖4.0碳酸酐酶碳酸酐酶H2CO3 9.0过氧化氢酶过氧化氢酶H2O2 25蔗糖酶蔗糖酶蔗糖蔗糖28糜蛋白酶糜蛋
6、白酶甘氨酰酪氨酰甘氨酸甘氨酰酪氨酰甘氨酸1082.反映酶与底物的亲合力KmKm值越大,酶与底物亲合力越小,值越小,酶与底物亲合力越大。3.选择酶的最适底物物有不同的Km值取决于酶的种类和底物的性质,在酶一定时,不同底使酶促反应容易进行,并节省底物用量。Km值。酶活力测定时,应优先选择酶的最适底物,4.大反应速度的比率计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最根据米-曼氏方程可以计算5.设计适宜的底物浓度活性,一般要求初速度达到最大速度的酶促反应进程曲线表明,只有初速度才能真正代表酶消耗率为90%95%、底物致于使底物浓度过高而造成浪费。1%5%。这样既可以近似地表示酶活性,又不(三)Vmax的应用
7、?定义:Vmax指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。?应用:Vmax可用来计算酶的转化率(TN),即单位时间内每分子酶可使底物发生化学反应的分子数,单位为分子数/秒。当反应速度达到最大反应速度时,如果已知酶量,则可计算出酶的转化率:TN=底物转化量(mol/s)/酶量(mol)(四)Km和Vmax的测定1Linweaver-Burk作图法,又称为双倒数作图法1 Km+SKm 1 1=+v VmaxSVmax SVmax2Cornish-Bowden作图法又称为直线线性作图法。第二节第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型酶活性测定方法及酶学分析的类型?酶活性的测定方法?工具酶?酶偶联测定法?底物
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