噬菌体展示技术的原理课件.ppt

1、噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术的原理 噬菌体展示的基本概念 将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合,并在其表面展示,同时将其遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中。直接将可见的表达型与其基因型联系在一起,利用其配体的特异性亲和力,将所感兴趣的蛋白 质或多肽挑选出来。多年来,噬菌体展示技术被用于抗体的制备、多肽及蛋白质和酶的制备。特别是近几年来,该技术被作为一种新工具用于多肽和蛋白质药物的发现与研制、蛋白质与蛋白质的相互作用及蛋白质与DNA相互作用的研究、蛋白质结构和功能 的 研 究以 及基 因 治 疗 药 物 的 定 向 传 递等 多 方 面 的研究。一一、噬菌体展示技术的原

2、理 Lead Hv Link Lv PIII PIII 表达型 融合蛋白 P 菌毛蛋白 35个拷贝 P 主要衣壳蛋白 27003000个拷贝 基因型 噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一起。选择方法：淘选（Panning)而不是 筛选（Screening)Solid phase selection with immunotubes B B B B B B v v Immunotube coated with antigen coated with steptavidin and

3、biotinylated antigen B biotin antigen Solution phase selection with biotinylated antigen Bind to Streptavidin coated microtitre wells Wash to remove unbound phage particles.Elute bound phage Amplify eluted phage Repeat selection Analyze a)ELISA b)Specificity c)Sequencing d)Affinity e)Activity E.coli

4、 感染 和扩增?固相?淘选系统 完整细胞?组织，器官?常规法?淘选方法 正负法?竞争法?噬菌体展示技术最关键的优势有三：?第一，淘选 的高效率使得在极低的 存在 水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；?第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；?第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。?噬菌体（M13,T7,T4,?)?病毒（反转录病毒，杆状病毒）?表面展示系统 细菌（葡萄球菌，E.Coli)?酵母?体外共价连接（蛋白 DNA,?蛋白RNA)?诊断?被动免疫?抗体 蛋白质结构分析?药物导航?蛋白质纯化 应用

5、范围：?受体配体?信息传递?蛋白质蛋白质 诘抗剂?蛋白质DNA 抑制剂?蛋白质其他?多肽 诊断?基因表达控制?中和活力?药物及药物导航?酶及底物 噬菌体抗体库的构建 Antibody IgG structure Antibody IgG structure V H V L C L C H1 C H2 C H3 Hinge(Fab)2 Fab Fc Membrane Extension Antibody IgG structure V H V L C L C H1 C H2 C H3 Antibody IgG structure V H V L C L C H1 C H2 C H3 Fv Fv

6、V H V L scFv V H V L Single Chain Fragment variable 噬菌体展示ScFv抗体操作示例 PCR 产物的酶切（先平连再消化）载体的酶切 库的连接反应 电穿孔转化 感受态 E.Coli TG1 细胞的制备 抗体库的构建 筛选 检测 分泌型ScFv 的产生 测序 包括数轮 识别-洗脱-复制 的过程?活性克隆制备 质粒DNA，VH 和VL基因重新 克隆于通用载 体，利用通用 引物测序。?PCR 直接测序?电穿孔导入?加入AMP 抗性?先构建轻链，再构建重链?加入辅助噬菌体?加入卡那霉素?PEG-NaCl收集 a)ELISA检测 b)特异型检测 c)序列测

7、定 d)亲和性测定 e)活性测定 单克隆抗体 噬菌体抗体 杂交瘤技术 展示技术 宿主细胞:杂交瘤 细菌 筛选范围:103 107?109 时间:几个月 几周 操作:繁杂 相对简单 免疫:必须 可避免 人源抗体:?+费用:高 低 生产量:有限 无限 基因获取:再克隆 直接 应用前景:有限 不可估 二、噬菌体展示技术的应用现状 1.抗体：抗狂犬病毒的单链抗体，抗HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，此抗体可专一性杀死被HIV-1感染并表达有gp120的淋巴细胞,中和响尾蛇毒素的单链抗，等等。2.疫苗：展示在噬菌体表面的HIV-1 的gp120-V3 环 可象天然抗原一样引起显著的免疫应答,等等。3.多肽

8、类药物：如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定出来；已获得一13 肽，它能中和蛇毒-bungarotoxin；从CX7C 多肽库中掏选到一个多肽能与 Hantavirus 结合，并使该病毒不能结合或感染细胞。人血管促生素（angiogenin）是一种能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状8肽能与血管促生素结合，并能阻遏血管促生素的活性；等等。4.肿瘤药物导航载体：用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展示文库中淘选到的多肽或单链抗体，可以作为抗癌药物的定向输送工具。一个成功的实例是：将噬菌体多肽展示库注射入具有肿瘤的小鼠体内，然后杀死小鼠，取出肿瘤，再将结合其上的

9、噬菌体洗脱下来。展示在其上的多肽具有与该肿瘤的特异性亲和力。将此多肽与细胞毒素 doxorubicin 偶联。结果显示，此偶联物具有更强的抑制肿瘤的效果.5.酶：例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类，等等 6.底物与抑制剂：主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。7.信息传递研究信息传递研究:利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一个 Hantaviral 受体；受体的配体，如血管促生素、-bungarotoxin，和一些大蛋白分子中的折叠区域，如 SH2、SH3 和 WW 区域。从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的多肽,因此用完整细胞可以从多肽库中

10、找到受体的高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。8.DNA结合蛋白结合蛋白：锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物，这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别和结合特殊的 DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用于创造一个大的、具有识别不同 DNA 序列的 锌指的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设计 锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干扰病毒感染生活周期。9.蛋白质组学蛋白质组学：噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白质合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其有特异结合力的多肽和蛋白质，其构建的文库的滴度可达1012。蛋白质组学的基本点就是利用蛋白质-蛋白质的相互作用，对成千上万种蛋白质同时进行分析。而噬菌体展示技术正好能符合这种要求。例：将噬菌体展示cDNA 文库制成蛋白点阵，成功的应用于寻找与过敏症有关的蛋白质。