凝胶层析分离技术课件.ppt

1、第十章 凝胶层析法第十章 凝胶层析法第一节凝胶的条件和类型第二节基本原理第三节 凝胶层析的实验技术第四节 凝胶层析的应用第一节 凝胶的条件和类型?层析凝胶必须具备下列条件：?凝胶层析中常用凝胶类型层析凝胶必须具备下列条件1.凝胶必须是化学惰性的2.凝胶的化学性质必须是稳定的3.凝胶上没有或只有极少量的离子基团4.凝胶必须具有足够的机械强度凝胶层析中常用凝胶葡聚糖凝胶(dextran gel，Sephadex)聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，Bio-Gel P)琼脂糖凝胶(agarose gel，Sepharose)琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶(Superdex)葡聚糖凝胶

2、部分结构葡聚糖凝胶部分结构(Sephadex)聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶的部分结构(Bio-Gel P)琼脂糖凝胶(Sepharose)(Sepharose)琼脂糖凝胶的部分结构第二节基 本 原 理一、凝胶的结构与分子筛效应二、凝胶床总体积三、分配系数（Kd）四、有效分配系数（Kav）五、分子量与Ve 的关系一、凝胶的结构与分子筛效应动画演示二、凝胶床总体积Vt：柱床“总容积”，Vo：即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相容积Vi：即凝胶颗粒内部所含水相的容积。Vg：凝胶本身的容积；VtVo十Vi十Vg 或Vt-Vo=Vi十Vg，三、分配系数（Kd）0Kd1，Ve在Vo与Vo十Vi之间变化

3、Ve：为实际测得的洗脱容积，自样品加入到组分最大浓度(峰)出现时所流出的容积；ViVoVeKd)(?VeVo十KdVi四、有效分配系数（Keff）（）（00VVVVKteeff?ViVoVeKd)(?将Vt-Vo代替Vi，则：即：VeVo十Keff(Vt-Vo)实际上，Keff是是将以水作为固定相(Vi)改为水与凝胶颗粒(Vt-Vo)作为固定相，而洗脱剂(Ve-Vo)为流动相。Kav与Kd 对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点，五、Ve与相对分子量的关系Ve=K1-

4、K2lgM K1、K2为常数，Ve可用如下表达式代替，Ve-Vo（分离体积），Ve/Vo（相对保留体积），Ve/Vt（简化洗脱体积），Keff（相对洗脱体积）在不同型号凝胶上蛋白质的选择曲线的差异第三节 凝胶层析的操作技术一、凝胶的选择与处理二、凝胶装拄制备三、样品上柱及洗脱四、实验操作五、凝胶柱的保养和凝胶的保存一、凝胶的选择?排阻范围与粒度的选择?凝胶用量的计算排阻范围的选择粒度的选择粒度的选择凝胶用量的计算干凝胶用量（g）：r2h/膨胀度（膨胀度：床体积/克干胶）理论用量（1+10%）凝胶的处理SephadexG-25G-75G100G-150G-200（中）湿球粒度 m100-2001

5、20-20020-200120-200120-200吸水值 ml/g 干胶2.50.27.5 0.510.0 1.015.0 1.520.0 2.0床体积 ml/g 干胶4-612-1515-2020-3030-40球蛋白分离范围 KD1-53-804-1505-3005-600二、凝胶装拄制备1.柱结构（、h）的选择2.装柱3.柱鉴定柱结构（、h）的选择三、样品上柱及洗脱?加样量的控制分析：1-2ml/100ml 床体积制备：10-30ml/100ml 床体积?洗脱液的选择控制凝胶收缩?影响洗脱的因素流速对蛋白质分辨率的影响操作压与流速的关系流速对蛋白质分辨率的影响黏度对分辨率的影响黏度对分

6、辨率的影响凝胶柱层析操作压操作压与流速的关系加样量对分辨率的影响I.加养量少时，A、B二种物质充全分开。II.加养量适当时，A、B 二种物质刚刚分开。III.加养量太大时，A、B二种物质只能部分分开。四、凝胶层析的操作技术1.凝胶的处理2.柱层析系统的安装3.凝胶装拄4.样品上柱及洗脱5.Vo、Vi、Vt的测定6.标准曲线的制作及Kd和Kav的计算7.凝胶柱的保养和凝胶的 保存1、凝胶的处理将称好的干粉倾人过量的洗脱液中，室温下充分溶胀。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。为了缩短溶胀时间，可在沸水浴中加热溶胀3-5小时，这样还可以杀死细菌和霉菌，并排除凝胶内气泡。为了保证流速稳定，获得较好的实验

7、结果，使用前用倾泻法倾去不易沉下的较细颗粒，使凝胶颗粒大小一致，。2、柱层析系统的组装柱层析系统的安装3、凝胶装柱。将层析柱垂直装载支架上，将层析柱垂直装载支架上，将下端输液管夹紧；将下端输液管夹紧；向柱中加入约向柱中加入约1/31/3体积的体积的0.90.9NaClNaCl溶液；溶液；将一细玻棒伸入柱内，靠近将一细玻棒伸入柱内，靠近管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内加入混匀的凝胶溶液；凝胶加至层析柱顶端约凝胶加至层析柱顶端约3cm时，打开柱下端输液开关，使流速控制在0.25-0.5ml/cm2 2nimnim。连续而缓慢的加凝胶直到稳定在离管口约5cm5cm处。（防止空

8、气进入凝胶床）4、样品上柱及洗脱加样量的控制分析：1-2ml/100ml 床体积，制备：10-30ml/100ml 床体积洗脱液的选择：洗脱液应与浸泡凝胶时所用的溶液一致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果。凝胶层析加样操作示意图洗脱与自动收集记录凝胶柱层析实物连接凝胶层析中的分离行为凝胶层析加样操作示意图1、平衡好的层析柱。2、沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起。3-4、打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，5-7、当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。8-9、最后加入34mL洗脱液于凝胶上。10、

9、连接柱层析系统，自动收集记录。洗脱与自动收集记录凝胶柱层析实物连接凝胶层析中的分离行为蓝葡聚糖（兰色）、血红蛋白（红色）、铬酸钾(黄色)5、Vo、Vi、Vt的测定Vo的测定选用分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000（或一种不被凝胶滞留的有颜色的大分子物质，便于观察)，测定它的洗脱曲线，洗脱峰峰顶洗出的体积（Veo）就是该柱的Vo值。Vi的测定选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出其洗脱体积Vei，减去Vo就是该柱的Vi。常用铬酸钾(黄色)或有UV吸收的物质如N-乙酰酪氨酸乙酯来测定Vi。Vt的测定式中，为常数 3.14，D 为柱直径，h为凝胶床的高度。hDVt?22）（?6、标准曲线

10、的制作及Kd和Kav的计算?按操作技术4的方法，将1mL标准蛋白质混合液上柱，然后用0.025molL氯化钾-0.2molL乙酸溶液洗脱。流速3mL10min，3mL管。用核酸蛋白质检测仪280nm处检测，用部分收集器收集，记录洗脱曲线，或收集后用紫外分光光度计于280nm处测定每管光吸收值。?以管号(或洗脱体积)为横坐标，光吸收值为纵坐标作出洗脱曲线。?根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积(Ve)，以蛋白质分子量的对数1gMr，为纵坐标，Ve为横坐标，作出标准曲线。?根据已测出的Vo和Vi以及Vt，分别求出Kd和Kav7、未知样品分子量的测定完全按照标准曲线的条件操作。根据紫外检测的洗脱

11、峰位置，量出洗脱体积，重复测定1-2次，取其平均值。也可以计算出Kav分别由标准曲线查得样品的分子量。8、凝胶柱的保养和凝胶的保存凝胶的保存可采用以下两种方法：（1）经常使用的凝胶以湿态保存为宜，加入适当的抑菌剂。常用的抑菌剂:0.02 叠氮钠(2)较长时期不使用的凝胶可采用干燥保存法。依次用70、90和95乙醇逐步脱水，使凝胶皱缩，最后用乙醚洗涤干燥或在60-80下烘干。第五节凝胶层析的应用?脱盐和浓缩?分离生命物质?测定分子量思考题凝胶过滤分离大分子物质的机理是什么？分子量为8万和10万的蛋白质能否在Sephadex G-75柱中分开？为什么？概述哪些因子影响凝胶过滤的分辨率？为什么？在460cm和160cm；140cm和180cm两组交两组交联葡聚糖G-100柱中，当每cm2截面积上流速和分级收集体积一致时，问两组柱中那一种分辨率高？为什么？在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为140ml,其外水体积和总体积分别为60和200ml，求分配系数是多少？在5.060cm的凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最多加样体积是多少毫升？稍息