固相膜免疫分析技术技术课件.ppt
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- 固相膜 免疫 分析 技术 课件
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1、临床免疫学检验临床免疫学检验固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术概述:概述:随着免疫学技术和相关生物化学技术的随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展,检测方法上派生出了多种类型的固相发展,检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫膜免疫快速检测快速检测试验。该类试验的最大特点试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备,对检测人员稍加培训即是不需要大型设备,对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。能掌握操作要求和判定标准。固相膜免疫分析技术:固相膜免疫分析技术:是以微孔膜作为固相载体,利用液体可以流过是以微孔膜作为固相载体,利用液体可以流过微孔膜也可通过毛细管
2、作用在膜上向前移行的特性,微孔膜也可通过毛细管作用在膜上向前移行的特性,以酶标记或者各种有色颗粒(如彩色胶乳、胶体金、以酶标记或者各种有色颗粒(如彩色胶乳、胶体金、或胶体硒等)标记抗原或抗体作为标记物,通过抗或胶体硒等)标记抗原或抗体作为标记物,通过抗原抗体反应进行抗原或抗体检测的快速检验方法。原抗体反应进行抗原或抗体检测的快速检验方法。常用的固相膜常用的固相膜玻璃纤维素玻璃纤维素(fiberglass)膜膜尼龙尼龙(nylon)膜膜聚偏氟乙稀聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜膜硝酸纤维素硝酸纤维素(nitrocellulose,NC)膜膜固相膜的特点固相
3、膜的特点多孔性多孔性 滤纸滤纸 毛细管作用毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性高度敏感性易于漂洗易于漂洗 操作简便操作简便固相膜的技术要求固相膜的技术要求孔径:穿流法的膜一般选择孔径:穿流法的膜一般选择0.4m0.4m左右;横流左右;横流法的膜可选择法的膜可选择5m5m10m10m流速:孔径和分布结构影响膜的流动速率,孔流速:孔径和分布结构影响膜的流动速率,孔径大,流速快。以径大,流速快。以ml/cm2/minml/cm2/min表示表示蛋白质结合力:吸附力很强,以蛋白质结合力:吸附力很强,以g/cmg/cm2 2表示表示均一性均一性 优质的膜具有良好的均
4、一性。优质的膜具有良好的均一性。固相固相NC膜膜固相膜免疫测定的特点固相膜免疫测定的特点优点优点不足之处不足之处简便,快速简便,快速敏感度略低,价格略高(与敏感度略低,价格略高(与ELISAELISA比)比)单份测定单份测定精密度较差,质控困难精密度较差,质控困难保存期长(优质试剂)保存期长(优质试剂)稳定性较差(普通试剂)稳定性较差(普通试剂)可测定物范围广(主要为定性试验)可测定物范围广(主要为定性试验)不易制备定量、半定量试剂不易制备定量、半定量试剂感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断妊娠、排卵的诊断妊娠、排卵的诊断肿瘤标志肿瘤标志心肌标志心肌标志滥用药物滥用药物固相微孔膜测定种类固相微孔膜
5、测定种类 斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay,DIGFA)斑点金免疫层析试验斑点金免疫层析试验(dot immunogold chromatographic assay,DICA)斑点斑点ELISA(dot enzyme linked immunosorbent assay,Dot-ELISA)酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot,ELISPOT)免疫印迹法免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)放射免疫沉淀试验放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecip
6、itation assay,RIPA)常用的标志物常用的标志物o酶和有色微粒子酶和有色微粒子o彩色胶乳彩色胶乳o荧光素荧光素o胶体金和胶体硒等胶体金和胶体硒等o其中以胶体金和荧光素最为常用胶体金免疫技术胶体金免疫技术(免疫金标记技术或金免疫技术)o 胶体金免疫技术(胶体金免疫技术(colloidal gold immunoassay)是以胶体金作为标记物(示踪剂或显色剂),是以胶体金作为标记物(示踪剂或显色剂),应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。o 1971年由年由Faulk和和Taylor始创,最初用于免疫电始创,最初用于免疫电镜技术。镜技术
7、。o 目前得以广泛应用。目前得以广泛应用。胶体金免疫技术胶体金免疫技术 o 金免疫测定技术:斑点免疫金金免疫测定技术:斑点免疫金渗滤渗滤试验试验 斑点免疫金斑点免疫金层析层析试验试验o 金免疫组织化学染色技术:金免疫组织化学染色技术:金免疫金免疫电镜电镜染色技术染色技术 金(银)免疫金(银)免疫光镜光镜染色技术染色技术 胶体金与免疫金的制备胶体金与免疫金的制备o 1.胶体金的特性及制备胶体金的特性及制备o 2.免疫金的制备免疫金的制备 胶体金与免疫金的制备胶体金与免疫金的制备o 1.胶体金的特性及制备胶体金的特性及制备胶体金的结构胶体金的结构 胶体金特性胶体金特性胶体金的制备胶体金的制备 胶体
8、金鉴定胶体金鉴定 和保存和保存注意事项注意事项 胶体金的结构胶体金的结构o 胶体金(胶体金(colloidal gold)也称金)也称金溶胶(溶胶(gold solution),是由),是由金金盐盐被还原成被还原成金原子金原子后形成的金后形成的金颗粒悬液。颗粒悬液。o 胶体金颗粒由一个基础金核(胶体金颗粒由一个基础金核(原子金原子金Au)及包围在外)及包围在外的双离子层构成,紧连在金核表面的是内层的双离子层构成,紧连在金核表面的是内层负离子负离子(AuC12),外层离子层),外层离子层H+则分散在胶体间溶液中则分散在胶体间溶液中o 金颗粒间金颗粒间静电静电相互排斥而悬浮形成一种稳定的胶体状态。
9、相互排斥而悬浮形成一种稳定的胶体状态。o 胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核,较小的胶体胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核,较小的胶体金颗粒基本是圆球形的,较大的胶体金颗粒(一般指大于金颗粒基本是圆球形的,较大的胶体金颗粒(一般指大于30nm以上的)多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体以上的)多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态金的颗粒形态。胶体金特性胶体金特性o(1)胶体金一般性质:)胶体金一般性质:胶体金颗粒大小多在胶体金颗粒大小多在1100nm,微小金颗,微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中,成为胶体金溶液。胶体
10、金因而具有胶体体中,成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特性,特别是对电解质的敏感性的多种特性,特别是对电解质的敏感性。(2)呈色性和光吸收性:对同一种物质的水溶胶金颗粒来)呈色性和光吸收性:对同一种物质的水溶胶金颗粒来说,粒子大小不同,颜色亦不同:说,粒子大小不同,颜色亦不同:o 胶体金颗粒在胶体金颗粒在520nm之间,吸收波长之间,吸收波长520nm,呈,呈葡萄酒红色。葡萄酒红色。o 胶体金颗粒胶体金颗粒2040nm之间吸收波长之间吸收波长530nm,液体为,液体为深红色,深红色,60nm的金溶液主要吸收波长的金溶液主要吸收波长600nm,金溶,金溶液呈兰紫色,若离心去掉较大的金颗粒,
11、溶胶呈红色。液呈兰紫色,若离心去掉较大的金颗粒,溶胶呈红色。o 根据这一特点,用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长根据这一特点,用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小。大小可粗略估计金颗粒的大小。呈色和光吸收性呈色和光吸收性粒子大小不同,光吸收性不同,颜色亦不同:粒子大小不同,光吸收性不同,颜色亦不同:o 1020nm,吸收峰,吸收峰530nm,呈橙色。,呈橙色。o 2080nm,吸收峰,吸收峰600nm,呈紫红色。,呈紫红色。o 根据这一特点,可用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波根据这一特点,可用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小。长大小可粗略估计金
12、颗粒的大小。稳定性稳定性o 稳定稳定:颗粒做布朗运动不易受重力影响而下沉颗粒做布朗运动不易受重力影响而下沉.o 又不稳定又不稳定:自身因素与外部因素自身因素与外部因素.o 自身因素自身因素:相互碰撞而合并为较大颗粒而下沉。相互碰撞而合并为较大颗粒而下沉。o 外部因素外部因素:电解质、浓度、温度、稳定剂。电解质、浓度、温度、稳定剂。胶体金的制备胶体金的制备 制备原理制备原理 o 向一定浓度的向一定浓度的氯金酸氯金酸溶液内加入一定量的溶液内加入一定量的还原还原剂剂,使金离子变成金原子,形成金颗粒悬液。,使金离子变成金原子,形成金颗粒悬液。o 常用的还原剂:白磷、硼氢化钠、抗坏血酸、常用的还原剂:白
13、磷、硼氢化钠、抗坏血酸、柠檬酸钠柠檬酸钠、鞣酸等。、鞣酸等。技术要点技术要点p 最常用的制备方法为柠檬酸三钠还原法最常用的制备方法为柠檬酸三钠还原法柠檬酸盐还原法:柠檬酸盐还原法:先配制先配制HAuCl4HAuCl4水溶液,加热至沸水溶液,加热至沸搅动下准确加入一定量的柠檬酸三钠水溶液搅动下准确加入一定量的柠檬酸三钠水溶液继续加热煮沸一定时间。此时可观察到淡黄色的氯金继续加热煮沸一定时间。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快便灰色,继而转成黑色,酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快便灰色,继而转成黑色,随后逐渐稳成红色随后逐渐稳成红色冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积冷却至室温后用蒸馏水
14、恢复至原体积 四种粒径胶体金的制备及特性四种粒径胶体金的制备及特性鉴定和保存鉴定和保存o 指标:粒径大小,均一度,有无凝集指标:粒径大小,均一度,有无凝集o 粗略:日光;分光光度计粗略:日光;分光光度计o 电镜:统计胶体金的平均粒径。电镜:统计胶体金的平均粒径。良好的胶体金应该是清亮透明的。良好的胶体金应该是清亮透明的。若混浊或表面有漂浮物,提示有较多的凝集若混浊或表面有漂浮物,提示有较多的凝集颗粒。颗粒。胶胶 体体 金(金(1560 nm)优优 质质劣劣 质质o 室温、避光、无尘、洁净器皿:室温、避光、无尘、洁净器皿:3个月。个月。加入少许防腐剂(如加入少许防腐剂(如0.02NaN3)可有利
15、)可有利于保存。于保存。o 4,半年。半年。o-20-20o 尽快标记 鉴定和保存鉴定和保存注意事项注意事项 o(1)氯金酸易潮解,应干燥、避光保存。)氯金酸易潮解,应干燥、避光保存。o(2)氯金酸对金属有强烈的腐蚀性,因此在配制氯金)氯金酸对金属有强烈的腐蚀性,因此在配制氯金酸水溶液时,不应使用金属药匙称量氯金酸。酸水溶液时,不应使用金属药匙称量氯金酸。o(3)用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏)用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水,或者是高质量的去离子水。水,或者是高质量的去离子水。o(4)用以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的,)用以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的
16、,用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的,用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的,硅化方法可用硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟,二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟,用蒸馏水冲净后干燥备用。用蒸馏水冲净后干燥备用。免疫金的制备免疫金的制备o 概念:免疫金(概念:免疫金(immunogold)是指胶体是指胶体金与金与Ag或或Ab的结合物的结合物,有时称之为金探针。有时称之为金探针。o 原理:原理:不明,物理吸附,靠静电力相互吸引而牢固结不明,物理吸附,靠静电力相互吸引而牢固结合。不影响蛋白质的生物活性。合。不影响蛋白质的生物活性。目前多认为:o 当溶液的当溶液的pH值等
17、于或略高于蛋白质的值等于或略高于蛋白质的PI时,时,蛋白质分子的表面张力最大,易于吸附在金蛋白质分子的表面张力最大,易于吸附在金颗粒的表面。颗粒的表面。o 由于蛋白质分子牢固地结合在金的表面,形由于蛋白质分子牢固地结合在金的表面,形成一个蛋白层,阻止了胶体金颗粒的相互接成一个蛋白层,阻止了胶体金颗粒的相互接触,从而使金溶胶处于稳定状态触,从而使金溶胶处于稳定状态。技术要点技术要点(1)胶体金溶液的胶体金溶液的pH值调整:调节至值调整:调节至PI或偏碱。或偏碱。(2)蛋白质最适标记量的确定:系列稀释蛋白,加一蛋白质最适标记量的确定:系列稀释蛋白,加一定量胶体金,定量胶体金,NaCl,以红色保持不
18、变而蛋白含量最以红色保持不变而蛋白含量最低的一管为最适标记量。低的一管为最适标记量。(3)标记过程;搅拌、加一定量稳定剂(标记过程;搅拌、加一定量稳定剂(BSA/PEG)。)。(4)标记物纯化标记物纯化:超速离心法、超速离心法、凝胶过滤法。凝胶过滤法。免疫金的保存免疫金的保存 免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通、常是加入含稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性液通、常是加入含稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的的PBS或或Tris缓冲液。缓冲液。PEG和和BSA是最常用的稳定剂。是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用:为保护胶体金的稳定性,
19、使之便稳定剂有两大作用:为保护胶体金的稳定性,使之便于长期保存;为防止或减少免疫金复合物的非特异性于长期保存;为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。吸附反应。胶体金免疫测定技术胶体金免疫测定技术一、斑点金免疫渗滤试验一、斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay DIGFA)二、斑点金免疫层析试验二、斑点金免疫层析试验(dot immunogold chromatographic assay DICA)一、一、双抗体夹心法为例:双抗体夹心法为例:o 将将Ab点加在固相载体点加在固相载体NC膜上膜上(。o 当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时,标本中含当
20、滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时,标本中含Ag被膜上被膜上Ab捕获。捕获。o 其后加入的其后加入的免疫金免疫金与已结合在膜上的与已结合在膜上的Ag相结合。相结合。o 因胶体金本身呈红色,阳性反应即在膜中央显示红因胶体金本身呈红色,阳性反应即在膜中央显示红色斑点色斑点主要由渗滤装置、胶体金标记物、洗涤液、抗原参照品或抗主要由渗滤装置、胶体金标记物、洗涤液、抗原参照品或抗体阳性对照品四部分组成。其中渗滤装置是由塑料小盒、吸体阳性对照品四部分组成。其中渗滤装置是由塑料小盒、吸水垫料和已点加抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。水垫料和已点加抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。试剂盒一般都设有质控点,
21、质控点的大小或形状都不同于检试剂盒一般都设有质控点,质控点的大小或形状都不同于检测点,有的用大小点区分、有的用点横线区分,有的用横竖测点,有的用大小点区分、有的用点横线区分,有的用横竖线区分线区分(二)方法类型(二)方法类型o 1双抗体夹心法双抗体夹心法 o 2间接法间接法DIGFA双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原AB操作:加样操作:加样A;加加金标记物金标记物;洗涤洗涤B,观察观察阳性阴性间接法测抗体间接法测抗体阳性阴性固相膜固相膜固相固相抗原抗原待测待测抗体抗体金标二抗人金标二抗人人人IgGIgG快速检测(渗滤法)原理图快速检测(渗滤法)原理图二、二、斑点金免疫层析试验斑点金免疫层析试
22、验(dot immunogold chromatographic assay)原理:原理:o 滴加在膜一端的标本受膜的毛细管作用向另一滴加在膜一端的标本受膜的毛细管作用向另一端移动,端移动,犹如层析一般,犹如层析一般,被分析物与固定于载被分析物与固定于载体膜上某一区域的体膜上某一区域的AbAb或或AgAg结合,无关物则越过结合,无关物则越过该区域而被分离,然后通过胶体金的呈色条带该区域而被分离,然后通过胶体金的呈色条带来判定实验结果来判定实验结果。试纸条组成结构试纸条组成结构测试线测试线 (T线)线)控制线(控制线(C线)线)胶体金垫胶体金垫吸水滤纸吸水滤纸样品垫样品垫NC膜(硝酸纤维素膜)膜
23、(硝酸纤维素膜)层析方向层析方向PVC底板底板有有4 4个组分:、吸水纸(样品垫)。、玻璃纤维膜个组分:、吸水纸(样品垫)。、玻璃纤维膜(胶体金垫胶体金垫)。)。膜上吸附膜上吸附着干燥的金标抗体(流动带)。、硝酸纤维素膜,膜上包被着抗原或抗体条着干燥的金标抗体(流动带)。、硝酸纤维素膜,膜上包被着抗原或抗体条带和能与标记物直接起反应的质控物条带(检测带)。、吸水纸。以上各组带和能与标记物直接起反应的质控物条带(检测带)。、吸水纸。以上各组份首尾互相衔接。份首尾互相衔接。o 斑点金免疫层析斑点金免疫层析:以以NCNC膜为载体,结合膜为载体,结合抗原抗原抗体反应抗体反应、金标技术金标技术与蛋白质与
24、蛋白质层析层析技术的快技术的快速固相膜免疫分析技术。速固相膜免疫分析技术。DIGFA 穿流(穿流(flow through)DICA 横流(横流(lateral flow)(二二)方法类型方法类型 o 1.1.双抗体夹心法双抗体夹心法o 2.2.竞争法竞争法/抑制法抑制法 o 3.3.间接法间接法 1.Goldtestcontrol 结果观察结果观察 阳性阳性阴性阴性无无效效Goldtestcontrol2.2.竞争法测抗原竞争法测抗原标准抗原标准抗原Goldtestcontrol标本标本阴性结果阴性结果Goldtestcontrol结果观察结果观察 阳性阳性阴性阴性无效无效3.3.间接法测抗
25、体间接法测抗体o 待测血清标本中含有大量的非特异性待测血清标本中含有大量的非特异性IgG,o 降低了试验敏感性降低了试验敏感性.o 为消除其影响,间接法常设计成:为消除其影响,间接法常设计成:反流免疫反流免疫层析法层析法。o 与特异性与特异性IgG竞争结合金标抗人竞争结合金标抗人IgG,缺点:缺点:间接法间接法(反流免疫层析反流免疫层析)?AGoldB观察窗EFMarkerCTCT非特异性抗体非特异性抗体待测抗体待测抗体金标抗体金标抗体羊抗兔羊抗兔IgG 胶体金免疫组化技术胶体金免疫组化技术o 一、免疫金一、免疫金电镜电镜染色技术染色技术o 二、免疫金(银)二、免疫金(银)光镜光镜染色技术染色
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