医科大学精品课件：流式细胞术.ppt

1、 流式细胞术 郑州大学第三附属医院 检验科 石 瑛 TEL:15037169625 E-mail：syybr 临床检验诊断学研究生课程 参考书 n实用流式细胞术 北京大学医学部出版社 刘艳荣 主编 n临床流式细胞分析 上海科学技术出版社 王建中 主编 教学目的 n掌握流式细胞术的基本工作原理 n熟悉流式细胞术的临床及科研应用 n了解流式细胞术的质量控制 流式细胞术定义 n流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞 仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞 理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 流式细胞术特点 n流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞 器或微粒的结

2、构及功能不被破坏的状态下，通 过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信 号对细胞进行定量分析或纯化分选。 流式细胞仪 是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分 析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起 来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部 结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速 测量并可分类收集的高科技产品。 流式细胞仪常检测的细胞特性 细胞组成细胞功能 大小细胞表面/胞浆/核-特异性抗原 粒度细胞活性 DNA, RNA含量胞内细胞因子 蛋白质含量激素结合位点 钙离子, PH值, 膜电位酶活性 基本工作原理 流式细胞仪的结构组成 n激光及光束形成系统 n液流系统 n光信号收集系统 n电

3、子系统 n数据的存储、显示与分析系统 流式细胞术检测的几个重要过程 试验前 n实验目的与方法的选择 n实验流程的熟悉（说明书） n标本的收集与保存 n荧光抗体的选择与染色（是否需要同型对照？ 空白对照？阴性对照？阳性对照？） 试验中 n标本的处理 n实验技巧的掌握（刺激培养？膜分子丢失？破 膜？） n实验突发事件的处理能力（实验原理的掌握） n数据的处理与分析（百分数？荧光强度？凋亡 ？） 试验后 n数据的处理与分析（*） 开始试验 1. 标本制备 n外周血、采集物或骨髓：肝素或EDTA抗凝 n组织细胞：单细胞悬液（机械法） n培养细胞： n体液：肝素抗凝 抗凝剂的选择 n常用抗凝剂：EDTA

4、、肝素、ACD EDTA：同时可进行白细胞计数与分类，标本 48h内是稳定的； 肝素：标本72h内是稳定的；试验前要进行形态 学观察 ACD：标本72h内是稳定的；试验前要进行形态 学观察 n骨髓标本优先选择肝素抗凝 nEDTA适用于白细胞免疫分型分析，可以防止 成熟的髓系细胞贴壁造成细胞损失，且具有较 强的抗血小板凝集的能力；缺点：fsc特征丢 失较快 n肝素常用于白细胞功能研究，其可以更好的维 持细胞活性，放置更长时间，但是不适合血小 板的相关检测 2. 荧光染色 免疫荧光染色 n细胞表面抗原标记 n细胞内或核内抗原标记 n细胞内细胞因子测定 细胞周期和DNA分析应用比较少 n细胞表面抗原

5、标记 染色-溶血-洗涤-上机检测 n细胞内或核内抗原标记 透膜剂的选择 膜表面抗原染色-溶血-洗涤-透膜与固定（透膜 剂使用参照说明书）-细胞内抗原染色-洗涤-上 机检测 n细胞内细胞因子检测 原理：通过细胞内蛋白分泌物抑制剂，阻断细 胞内高尔基体介导的蛋白质转运，使细胞因子 积聚在细胞浆中，增强了细胞因子信号。 刺激培养（刺激剂+阻断剂）-细胞表面抗原 染色-固定和破膜-细胞内细胞因子染色-洗涤- 上机检测 荧光信号检测-荧光抗体组合 n荧光信号强弱： PEAPCPE-Cy5PerCp-Cy5.5FITCPerCp 如何选择荧光抗体 n荧光素的荧光强度 荧光素标记效率： 抗体检测抗原的密度：

6、 自发荧光：自发荧光水平高的细胞，应使用 发射波长较长的荧光染料 （APC） 如何选择荧光抗体 n非特异性结合 同型对照 荧光素直接与FcR结合 做多色分析时，要尽量选择荧光波谱重叠 较小的荧光染料进行组合。 荧光素的搭配 依据 n流式细胞仪检测的通道数 n需要同时检测的荧光抗体数 n厂家提供的荧光素种类和数目 3. 仪器调整及数据获取 n荧光补偿：指在流式细胞多色分析中，纠正荧 光素发射光谱重叠的过程，即从一个被检测的 荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。 荧光补偿的调节 荧光补偿 n除去某一荧光素误入另一荧光通道的发射光信 号 n荧光素的特性：某一种荧光素被任何通道上检 测的荧光信号的比

7、值（如FITC被FL1和FL2检 测到的值）是恒定不变的。 4. 数据分析与报告 n数据分析过程中，设门对于数据分析至关重要 某一抗原差异表达的细胞群 错表达细胞群 设门 n设门：在细胞分布图中指定一个范围或一片区 域，对其中的细胞进行单参数或多参数分析。 n门的形状：线性门、矩形门、圆形门、多边形 门、任意形状门和四象限门 分析 n单参数分析 n多参数分析 二维散点图 二维等高图 假三维图 三维图 多参数组合分析 单参数分析 Events：分析区域内的细胞数 %gate：门内细胞百分比 %total：检测细胞总数百分比 Mean：平均荧光强度 Geo mean：几何均数 CV：细胞荧光变异细

8、胞 Median：荧光强度的中值 Peak Ch：峰值道数 M1 M2 多参数分析-二维散点图 前向角：激光检测区正向收集的小角度散射光 。 与细胞的大小和细胞表面光滑度有关 。 散射光强，细胞大；反之，细胞小。 侧向角：细胞通过测量90方向的散射光 与细胞内部的精细结构和颗粒性质有关 散射光越强，细胞内部颗粒和细胞器越多 临床应用 n淋巴细胞亚群测定 n淋巴细胞功能分析 n血液病免疫分型 n肿瘤耐药基因筛查 n免疫缺陷病 n自身免疫病 n器官移植 流式细胞仪与显微镜的区别 区别流式细胞仪显微镜 光源激光自然光、灯光 对象细胞、生物粒子细胞、组织等 承载工具鞘液及流动室载玻片 检测信号光学信号形态及染色 放大方式PMT、放大电路目镜物镜、光学放大 统计计算机，5000人工，200 结果多参数，综合分析简单，单参数 科研设计 n研究目的明确 n研究方法清晰 n研究指标明了 n研究结果预测 n科研论文写作 实验前 框架 实验中 填补数据，图表 试验后 讨论 为什么要做流式细胞 n从基因水平进行验证？ n从蛋白水平进行验证？ n从细胞水平进行验证？ n功能研究？ 复习题 n流式细胞仪的分析检测原理是什么？ n何谓荧光补偿？ nFCM分析中有哪些数据显示方式，如何解 读结果及其设门分析的意义？ n流式细胞术有哪些临床应用价值？