流式细胞仪分析课件.ppt

1、流式细胞仪分析流式细胞仪分析 技术及应用技术及应用2022-12-11 流式细胞术（流式细胞术（FCM）是是以流式细胞仪为检测手段的一项以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对能快速、精确的对单个细胞单个细胞理化理化特性进行多参数定量分析和分选特性进行多参数定量分析和分选的新技术。的新技术。（图（图1、2、3）2022-12-11第一节第一节 流式细胞仪的分析及流式细胞仪的分析及 分选原理分选原理 流式细胞仪由液流系统、光学与信号转流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成。三大基本结构组成。流式细胞术所具

2、有的分析和分选功能主流式细胞术所具有的分析和分选功能主要涉及光学原理、光电转换原理和测试原理要涉及光学原理、光电转换原理和测试原理三部分。三部分。2022-12-11一、工作原理一、工作原理 基本组成结构基本组成结构1、液流系统：由样本和鞘液组成。、液流系统：由样本和鞘液组成。样本：待测细胞被制备成单个细胞样本：待测细胞被制备成单个细胞的悬液后经荧光染料标记的单克隆的悬液后经荧光染料标记的单克隆抗体染色；抗体染色；鞘液：是辅助样本流被正常检测的鞘液：是辅助样本流被正常检测的基质液。作用基质液。作用（图（图4）2022-12-112、光学系统：由激光光源、分光镜、光束成、光学系统：由激光光源、分

3、光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。形器、透镜组和光电倍增管组成。激光光源：多为气冷式氩离子激光器，激光光源：多为气冷式氩离子激光器，其激光束波长为其激光束波长为488nm，15mW。分色反光镜：反射较长波长的光，通过分色反光镜：反射较长波长的光，通过较短波长的光。较短波长的光。光束成形器：将激光器发射的激光束聚光束成形器：将激光器发射的激光束聚焦成高焦成高15m、宽宽57m的椭圆光斑。的椭圆光斑。2022-12-11 透镜组：将激光和荧光变成平行光，同透镜组：将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。时除去离散的室内光。滤片：长通滤片一允许长于设定波长的滤片：长通滤片一允许长于设定

4、波长的光通过；短通滤片一允许短于设定波长的光光通过；短通滤片一允许短于设定波长的光通过；带通滤片一允许一定带宽波长的光通通过；带通滤片一允许一定带宽波长的光通过，其他波长的光不能通过。过，其他波长的光不能通过。光电倍增管光电倍增管：检测荧光和散射光，同时检测荧光和散射光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。（图（图13）2022-12-113、数据处理系统：、数据处理系统：主要由计算机及其软件组成。主要由计算机及其软件组成。2022-12-11 基本工作原理基本工作原理 标志了特异性荧光染料的单细胞悬液标志了特异性荧光染料的单细胞悬液经喷嘴高速射

5、下，与水平方向的高度聚焦经喷嘴高速射下，与水平方向的高度聚焦的激光束垂直相交，单个细胞上标记的荧的激光束垂直相交，单个细胞上标记的荧光染料在通过激光光斑时被激发而产生特光染料在通过激光光斑时被激发而产生特异性荧光，同时，由于混合细胞群中细胞异性荧光，同时，由于混合细胞群中细胞大小和胞内颗粒的多少会被激发而产生不大小和胞内颗粒的多少会被激发而产生不同的散射光。在入射光束与液柱垂直的方同的散射光。在入射光束与液柱垂直的方向有荧光检测系统和散射光感受系统，用向有荧光检测系统和散射光感受系统，用于收集荧光信号和侧向散射光信号，前向于收集荧光信号和侧向散射光信号，前向散射光感受器在前向小角探测接受前向光

6、散射光感受器在前向小角探测接受前向光信号。信号。2022-12-11被接收的光电信号被光电倍增管转换成电被接收的光电信号被光电倍增管转换成电压脉冲和积分脉冲，使信号放大，该信号压脉冲和积分脉冲，使信号放大，该信号进入计算机系统进行数据转换、储存、分进入计算机系统进行数据转换、储存、分析、处理，按不同的检测设计采用相应软析、处理，按不同的检测设计采用相应软件程序对结果进行综合分析，并以图像和件程序对结果进行综合分析，并以图像和数据显示于荧光屏上。数据显示于荧光屏上。流式细胞仪产生分析的电信号主要是流式细胞仪产生分析的电信号主要是光散射信号光散射信号和和荧光信号荧光信号，流式细胞仪依据，流式细胞仪

7、依据细胞流经光照射区时细胞流经光照射区时电压讯号电压讯号的强弱来分的强弱来分析和分选细胞。析和分选细胞。（图（图5）（图）（图10）2022-12-11二、散射光的测定二、散射光的测定 细胞对光的散射是细胞在未遭细胞对光的散射是细胞在未遭受任何破坏情况下固有的特性。受任何破坏情况下固有的特性。2022-12-11 前向散射光（前向散射光（FS）由激光束前方的由激光束前方的FS检测器收集，检测器收集，FS信信号的强弱与细胞的体积大小成正比，用于号的强弱与细胞的体积大小成正比，用于检测细胞或其他粒子物质的检测细胞或其他粒子物质的表面属性表面属性。（图（图11）（图（图6）2022-12-11 侧向

8、散射光（侧向散射光（SS）由激光束垂直方向的侧向检测器收由激光束垂直方向的侧向检测器收集，集，SS信号的强弱与细胞或其他颗粒的信号的强弱与细胞或其他颗粒的大小。形状及粒度成正比。大小。形状及粒度成正比。SS用于检测用于检测细胞细胞内部结构属性内部结构属性，可获得有关细胞内，可获得有关细胞内超微结构和颗粒性质的参数。超微结构和颗粒性质的参数。（图（图12）（图（图7）2022-12-11三、荧光测量三、荧光测量 荧光信号由被检细胞上标记的特异荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生，每种荧性荧光染料受激光激发后产生，每种荧光染料都有特定的激发波长，激发后又光染料都有特定的激发波长

9、，激发后又会产生特定波长荧光和颜色，通过滤光会产生特定波长荧光和颜色，通过滤光片，将不同波长的散射光，荧光信号区片，将不同波长的散射光，荧光信号区分并送到不同的光电倍增管，经过一系分并送到不同的光电倍增管，经过一系列信号转换、放大、数字化处理，就可列信号转换、放大、数字化处理，就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞百分率。染料的细胞百分率。2022-12-11 选择不同的单克隆抗体及荧选择不同的单克隆抗体及荧光染料就可以利用流式细胞仪同光染料就可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同特时测定一个细胞上的多个不同特征。征。流式细胞仪的检测原理中最

10、流式细胞仪的检测原理中最重要的一点就是检测荧光的特定重要的一点就是检测荧光的特定发射波长。发射波长。2022-12-11 光信号测量光信号测量 线性放大器用于测量信号强度变化范围线性放大器用于测量信号强度变化范围较少或代表生物学线性过程的信号。较少或代表生物学线性过程的信号。对数放大器用于测量信号强度变化范围对数放大器用于测量信号强度变化范围大且光谱信号较复杂的信号。大且光谱信号较复杂的信号。（图（图13）流式细胞仪中最常用于单抗标记的荧光流式细胞仪中最常用于单抗标记的荧光染料是染料是FITC、PE、ECD或或PeCy5。2022-12-11 荧光补偿荧光补偿（图（图8）通常用荧光补偿的方法来

11、消除通常用荧光补偿的方法来消除重叠信号，保证检测信号的正确性。重叠信号，保证检测信号的正确性。2022-12-11四、细胞分选原理四、细胞分选原理 基本原理基本原理 当细胞悬液形成液流柱经流动室，通过当细胞悬液形成液流柱经流动室，通过机械振动使液流柱断裂成一连串均匀的液滴，机械振动使液流柱断裂成一连串均匀的液滴，当实验设计中设定了被分选细胞的特性参数当实验设计中设定了被分选细胞的特性参数时，此类细胞在形成液滴时会被充电，使其时，此类细胞在形成液滴时会被充电，使其带有正电荷或负电荷，带电荷的液滴在落入带有正电荷或负电荷，带电荷的液滴在落入电极偏转板的高压静电场，依所带电荷是正电极偏转板的高压静电

12、场，依所带电荷是正或是负而发生向右或向左道偏转，落人指定或是负而发生向右或向左道偏转，落人指定的收集器中，完成细胞分选的目的。的收集器中，完成细胞分选的目的。（图（图14）（图（图9）2022-12-11 技术要求技术要求1、分选速度：至少、分选速度：至少5000个个/秒，秒，与分选细胞在悬液中的含量有关。与分选细胞在悬液中的含量有关。2、分选纯度：除与仪器的精密度、分选纯度：除与仪器的精密度相关外，还与被分选细胞与其他相关外，还与被分选细胞与其他细胞有无相互重叠相关。细胞有无相互重叠相关。2022-12-113、分选收获率：指设定通过测量点的分、分选收获率：指设定通过测量点的分选细胞与实际收

13、获的分选细胞之间的比选细胞与实际收获的分选细胞之间的比率。与被分选细胞与其他细胞有无相互率。与被分选细胞与其他细胞有无相互重叠相关，还与纯度有关，纯度重叠相关，还与纯度有关，纯度收获收获率率。4、分选得率：是指从一群体细胞悬液中、分选得率：是指从一群体细胞悬液中分辨出的目的细胞总量，再经分选后获分辨出的目的细胞总量，再经分选后获得的目的细胞实际比率。与分选速度相得的目的细胞实际比率。与分选速度相关，分选速度关，分选速度分选得率分选得率。2022-12-11第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析略！略！2022-12-11第三节第三节 流式细胞仪免疫流式细胞仪免疫 分析的技术要求分析的技

14、术要求一、免疫检测样品制备一、免疫检测样品制备 制备单细胞悬液是最关键的第一步。制备单细胞悬液是最关键的第一步。外周血淋巴细胞样品的制备外周血淋巴细胞样品的制备 单个核细胞的分离制备，最常用单次密单个核细胞的分离制备，最常用单次密度梯度离心法度梯度离心法2022-12-11 培养细胞的样品制备培养细胞的样品制备 新鲜实体组织单细胞悬液的制备新鲜实体组织单细胞悬液的制备 常用方法有机械法、酶处理法、化学试常用方法有机械法、酶处理法、化学试剂处理法和表面活性剂处理法。剂处理法和表面活性剂处理法。单细胞悬液的保存单细胞悬液的保存1、深低温保存法、深低温保存法2、乙醇或甲醇保存法、乙醇或甲醇保存法3、

15、甲醛或多聚甲醛保存法、甲醛或多聚甲醛保存法2022-12-11二、免疫分析中常用的二、免疫分析中常用的 荧光染料与标记染色荧光染料与标记染色 常用的荧光染料常用的荧光染料荧光染料需具备条件：荧光染料需具备条件：1、有较高的量子产额和消光系数；、有较高的量子产额和消光系数；2、对、对488nm的激发光波长有较强的吸收；的激发光波长有较强的吸收；3、发射光波长与激发光波长之间有较大的、发射光波长与激发光波长之间有较大的波长差；波长差；4、不影响结合抗体自身的特异性。、不影响结合抗体自身的特异性。2022-12-11常用荧光染料：常用荧光染料：1、异硫氰酸荧光素（、异硫氰酸荧光素（FITC）：）：最

16、常用，发最常用，发亮绿色荧光，但发射荧光强度易受亮绿色荧光，但发射荧光强度易受PH值值影影响。响。2、罗丹明：发红色荧光，缺点是不易溶于、罗丹明：发红色荧光，缺点是不易溶于水。水。3、藻胆蛋白类：发橙色至红色荧光，最常、藻胆蛋白类：发橙色至红色荧光，最常用的是藻红蛋白（用的是藻红蛋白（PE）。）。2022-12-11 免疫荧光标记免疫荧光标记荧光染料与细胞成分结合的方式：荧光染料与细胞成分结合的方式：1、结构亲和式：以电力结合，为带正电荷的、结构亲和式：以电力结合，为带正电荷的荧光分子与带负电荷的核酸分子磷酸基团相荧光分子与带负电荷的核酸分子磷酸基团相互吸引互吸引2、嵌入结合方式：光分子直接嵌

17、入核酸碱基、嵌入结合方式：光分子直接嵌入核酸碱基对中。对中。3、共价键结合方式：细胞、共价键结合方式：细胞DNA键的连接之间键的连接之间以原子结合方式展开，荧光分子与其形成共以原子结合方式展开，荧光分子与其形成共价结合方式。价结合方式。2022-12-114、荧光标记抗体特异性结合方式：荧光、荧光标记抗体特异性结合方式：荧光分子与单克隆抗体的分子与单克隆抗体的F（ab）2片段氨基发片段氨基发生化学反应而形成荧光标记基团。生化学反应而形成荧光标记基团。前三种染色方式常用于细胞内成分的前三种染色方式常用于细胞内成分的染色分析，第四种方式为流式免疫荧光分染色分析，第四种方式为流式免疫荧光分析所常用。

18、析所常用。直接免疫荧光染色法直接免疫荧光染色法 间接免疫荧光染色法间接免疫荧光染色法 双参数或多参数分析时荧光抗体的组合双参数或多参数分析时荧光抗体的组合技术技术2022-12-11 细胞自发荧光细胞自发荧光 大部分哺乳动物细胞内的吡啶大部分哺乳动物细胞内的吡啶或黄素类核苷酸都存在自发荧光，或黄素类核苷酸都存在自发荧光，用紫外光或蓝光激发可蓝色或绿色用紫外光或蓝光激发可蓝色或绿色荧光。荧光。在免疫检测中，淋巴细胞的在免疫检测中，淋巴细胞的自发荧光强度易引起信号干扰，出自发荧光强度易引起信号干扰，出现假阳性结果，特别是在用现假阳性结果，特别是在用FITC标记染色时。标记染色时。2022-12-1

19、1三、流式细胞免疫学技术的质量控制三、流式细胞免疫学技术的质量控制 单细胞悬液制备的质量控制单细胞悬液制备的质量控制1、采用适当的制备方式、采用适当的制备方式2、温度与、温度与PH2022-12-11 细胞悬液免疫荧光染色的质量控制细胞悬液免疫荧光染色的质量控制1、温度对荧光染色的影响、温度对荧光染色的影响2、PH对荧光发射强度的影响对荧光发射强度的影响3、荧光染料浓度的控制、荧光染料浓度的控制4、固定剂对免疫荧光染色的影响、固定剂对免疫荧光染色的影响2022-12-11 仪器操作技术的质量控制仪器操作技术的质量控制1、光路与流路校正、光路与流路校正2、PMT校准校准3、绝对计数的校准、绝对计

20、数的校准2022-12-11 免疫检测的质量控制免疫检测的质量控制1、同型对照：为免疫荧光标记中的阴性、同型对照：为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组织来源不同，对照。由于荧光标记单抗的组织来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整及设置电流电压，在此基础上进照来调整及设置电流电压，在此基础上进行样本检测可使荧光标记单抗的信号保持行样本检测可使荧光标记单抗的信号保持特异性，如不用同型对照，结果的可靠性特异性，如不用同型对照，结果的可靠性将受到影响。将受到影响。2022-12-112、全程质控、全程质控 质控物质控物Immuno-Tro

21、l Cells是全是全血质控的冻干品，将其复溶后与待检血质控的冻干品，将其复溶后与待检标本一起标记、洗涤和检测，所得结标本一起标记、洗涤和检测，所得结果如达标定靶值，提示本次实验结果果如达标定靶值，提示本次实验结果可靠。可靠。2022-12-11第四节第四节 流式细胞术在免疫学流式细胞术在免疫学 检查中的应用检查中的应用一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型四、肿瘤耐药基因分析四、肿瘤耐药基因分析五、在五、在AIDS病检测中的分析病检测中的分析六、自身免疫性疾病

22、相关六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析抗原分析2022-12-11掌握：掌握：流式细胞仪的工作原理；流式细胞仪的工作原理；流式细胞仪的技术要点流式细胞仪的技术要点熟悉：流式细胞术在免疫学检查中的熟悉：流式细胞术在免疫学检查中的应用应用了解：流式细胞仪的数据显示与分析了解：流式细胞仪的数据显示与分析2022-12-11图图1 流式细胞仪流式细胞仪2022-12-11图图2 流式细胞仪流式细胞仪2022-12-11图图3 流式细胞仪流式细胞仪2022-12-11图图4 流式细胞流动池模拟图流式细胞流动池模拟图前向散射光前向散射光鞘液鞘液喷嘴喷嘴侧向荧光信号侧向荧光信号2022-12-11图图5

23、FCM工作原理流程图工作原理流程图鞘液鞘液分光镜分光镜红色荧光红色荧光绿色荧光绿色荧光90散散射光射光前向散前向散射光射光激光器激光器细胞收集管细胞收集管细胞悬液细胞悬液电荷环电荷环偏转板偏转板废液废液2022-12-11图图6 前向散射光示意图前向散射光示意图大颗粒大颗粒小颗粒小颗粒激光器激光器激光器激光器激光探测器激光探测器2022-12-11复杂性颗粒复杂性颗粒简单性颗粒简单性颗粒侧向散射光探测器侧向散射光探测器激光器激光器激光器激光器图图7 侧向散射光示意图侧向散射光示意图2022-12-11图图8 4色荧光峰形线图色荧光峰形线图FITC RD1 ECD PC5荧光波长（荧光波长（nm

24、）荧荧光光强强度度2022-12-11图图9 9 细胞分选原理细胞分选原理3、细胞分选、细胞分选2、细胞膜、胞、细胞膜、胞质、胞核着色质、胞核着色1、细胞悬液、细胞悬液4、细胞培养、细胞培养、研究研究喷嘴喷嘴激光激光2022-12-11图10 流式细胞仪工作原理喷嘴喷嘴压电晶体压电晶体分色反光镜分色反光镜阻断滤片阻断滤片偏转板偏转板废液抽吸废液抽吸前向散射光检测器前向散射光检测器激光器激光器样品样品鞘液鞘液液滴形成信号液滴形成信号液滴充电信号液滴充电信号F1 PMTF2 PMTF1F2散射散射2022-12-11图11 前向散射原理图2022-12-11图12 侧向散射原理图2022-12-11图13 流式细胞仪中滤片的位置光光源源测量区测量区光电二极管光电二极管半透半反镜半透半反镜PMT3PMT1PMT2分分色色反反光光镜镜滤片滤片1滤滤片片2阻阻断断滤滤片片2022-12-11图图14 14 液液滴滴形形成成过过程程 压电晶体压电晶体流动池流动池测量区测量区样品样品鞘液鞘液液滴形成信号液滴形成信号液滴充电信号液滴充电信号偏转板偏转板废液抽吸废液抽吸2022-12-11