大学精品课件：生物化学（英文版）Biochemistry-chapter 3 AA and primary structure of protein（part 2）.ppt

1、3.6 Peptide bonds link amino acids in proteins 3.7 Protein Purification Techniques 多肽的多肽的双缩脲反应双缩脲反应(Biuret(Biuret reaction)reaction)是是多肽特有多肽特有的颜色反应的颜色反应; ;双缩脲是双缩脲是 两分子的尿素经加热失去一分子两分子的尿素经加热失去一分子NHNH3 3而得到的产物而得到的产物。 双缩脲双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜- -双缩脲络合物，称为双缩脲络合物，称为 双缩脲反应双缩脲反应。含有。含有两个以上肽键两个以

2、上肽键的多肽（的多肽（三肽以上三肽以上），具有与双缩脲相），具有与双缩脲相 似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色紫红色或或蓝紫色蓝紫色络合物络合物 （540nm)540nm)。这是多肽定量测定的重要反应。这是多肽定量测定的重要反应。 3.6 Peptide bonds link amino acids in proteins 1. Discovery of peptide bond: NH3 加热加热 + 紫红色紫红色 络合物络合物 Peptide bond - linkage between amino acids is a amide bond

3、 Formed by condensation of the a-carboxyl of one amino acid with the a-amino of another amino acid (loss of H2O molecule) Primary structure - linear sequence of amino acids in a polypeptide or protein 2. Polypeptide chain nomenclature Amino acid “residues” compose peptide chains Peptide chains are n

4、umbered from the N (amino) terminus to the C (carboxyl) terminus Example: (N) Gly-Arg-Phe-Ala-Lys (C) (or GRFAK) Formation of peptide bonds eliminates the ionizable a- carboxyl and a-amino groups of the free amino acids = side chains contribute mostly to the protein charge, solubility , and shape pe

5、ntapeptide （五肽）（五肽） Main chain and side chain Peptide group(unit) Oligopeptide (up to about 20AA)Oligopeptide (up to about 20AA) Polypeptide (usually more than 20AA) Polypeptide (usually more than 20AA) Most of the ionic charges in proteins Most of the ionic charges in proteins are contributed by si

6、de chains of AAsare contributed by side chains of AAs 虽是单键却有双键性质 周边六个原子在同一平面上 前后两个a-carbon在对角(trans) C N C H a N C O C a 0.123nm 0.133nm 0.153nm 0.145nm C-N 0.145 nm (正常正常) C=N 0.133 nm C=N 0.125 nm (正常正常) 酰胺平面酰胺平面 由肽键周围的由肽键周围的6 6个原子组成的刚性平面个原子组成的刚性平面 C NH O O Ca C N Ca H 部分双键部分双键 O C NH + 偶极（偶极（0.28

7、） 肽平面（酰胺平面）肽平面（酰胺平面） 两两 个个 相相 邻邻 酰酰 胺胺 平平 面面 绕绕 Ca a 的的 旋旋 转转 Ca Ca Ca C C H O O N N R H H f y 四肽的结构四肽的结构 肽键的构型肽键的构型 稳定稳定 不稳定不稳定 肽的来源：肽的来源： 蛋白质水解蛋白质水解 激素：激素：insulin, 胰高血糖素胰高血糖素，催产催产 素素，加压素加压素，舒缓激肽舒缓激肽 活性肽活性肽 抗生素：短杆菌肽抗生素：短杆菌肽S，多粘菌素多粘菌素E， 放线菌素放线菌素D，抗菌肽抗菌肽 其其 它：脑啡肽它：脑啡肽，鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱， GSH 活性肽中存在活性肽中存在肽键肽键，A

8、A和和DAA，以防止，以防止 蛋白酶的水解。蛋白酶的水解。 L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽短杆菌肽S(S(环十肽环十肽) ) 由细菌分泌的多肽由细菌分泌的多肽，有时也都含有有时也都含有D D- -氨氨 基 酸 和 一 些 非 蛋 白 氨 基 酸基 酸 和 一 些 非 蛋 白 氨 基 酸 。 如如 : : 鸟 氨 酸鸟 氨 酸 （Ornithine,Ornithine, 缩写为缩写为 OrnOrn）。 Aspartame(Aspartame(阿斯巴甜阿斯巴甜 ) is a sweetening ag

9、ent which is a sweetening agent which is about 200 times sweeter than table sugar.is about 200 times sweeter than table sugar. 3.7 Protein Purification Techniques General procedure: 1. Preparing a solution of proteins; 2. Crude fractionation (separation); 3. Fine fractionation (separation); in as fe

10、w steps as possible in as short a time as possible Basic Principles of Protein Purification Ammonium sulfate fractionation Cell Organelle Homogenization Macromolecule Nucleic acid Carbohydrate(Lipid) SizeChargePolarityAffinity Small molecule Cell Debris Protein Amino acid, Sugar, Nucleotides, etc Ge

11、l filtration, SDS-PAGE, Ultrafiltration Ion exchange, Chromatofocusing, Disc-PAGE, Isoelectric focusing Reverse phase chromatography, HIC, Salting-out Affinity chromatography, Hydroxyapatite Juang RH (2004) BCbasics A. Preparing a solution of proteins 物理法物理法冻融法冻融法，超声波法超声波法，均浆法均浆法，研磨法等研磨法等。 酶裂解法酶裂解法就

12、是利用水解酶将细胞壁和细胞膜消化就是利用水解酶将细胞壁和细胞膜消化 的方法的方法，常用的水解酶有溶菌酶常用的水解酶有溶菌酶、葡聚糖酶葡聚糖酶、蛋白酶蛋白酶 、糖苷酶糖苷酶、壳多糖酶壳多糖酶、细胞壁溶解酶等细胞壁溶解酶等。其中溶菌酶其中溶菌酶 主要对细菌类有作用主要对细菌类有作用，其他酶对酵母作用显著其他酶对酵母作用显著。 Ultrasonic homogenizer B. Purification methods of proteins 1.Purification methods according to difference of solubility; 2.Purification me

13、thods according to difference of molecular mass (size); 3.Purification methods according to difference of charge; 4.Purification methods according to the interaction of a protein with other compounds; 1. Purification methods according to difference of solubility (1) Isoelectric precipitation (2) Sal

14、ting in and Salting out W=505（S2S1）/（10.285S2） V = 100（S2S1）/（1S2） (3) Organic solvent precipitation (4) Heating precipitation + = - + = - 盐溶盐溶 （Salting-in） Ionic strength 溶 解 度 + - NaCl NaCl KCl - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 蛋白质分子容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会

15、形蛋白质分子容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会形 成成双电层双电层破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。 Aggregate 蛋白质分子表面的疏水性区域，都聚集许多水分子，当盐类加入蛋白质分子表面的疏水性区域，都聚集许多水分子，当盐类加入 时，这些水分子被抽出，以便与盐离子进行水合，时，这些水分子被抽出，以便与盐离子进行水合，水化层水化层被破坏，被破坏， 暴露出来的疏水性区域互相结合，形成沉淀。暴露出来的疏水性区域互相结合，形成沉淀。 盐析盐析 （Salting-out ） Ionic strength 溶 解 度 Ammonium sulfate S

16、odium sulfate A little salting-in effect N H 4 + S O 4 2- = hydrophobic 1. 1. 降低水活性，使溶液的降低水活性，使溶液的介电常数下降介电常数下降，增加蛋白质溶质分子之间，增加蛋白质溶质分子之间 的作用力，因而聚集在一起。的作用力，因而聚集在一起。 2. 2. 去除去除水化层水化层。 Membrane protein 溶 解 度 Water-soluble protein - - - - - - + + + + + + + + + + - + - + + + + + - - - 有 机 溶 剂 Solvent % = h

17、ydrophilic 有机溶剂沉淀法（有机溶剂沉淀法（Organic solvent precipitation） 2. Purification methods according to difference of molecular mass(size) (1) Gel filtration chromatography（molecular exslusion chromatography) (2) membrane separation technique（Dialysis and ultrafiltration） (3) Density gradient centrifugation

18、(1) Gel filtration chromatography Vt = Vo + Vi + Vm Vi + Vm= Vt Vo Kd =（Ve Vo）/ Vi VeVo = ab logM logM = K1K2 Ve 分部收集器分部收集器 紫外监测仪紫外监测仪 记录仪记录仪 胶柱的装填方法： 缓 冲 液 平 衡 温 度 平 衡 静 置 胶 体 清 洗 胶 体 预 估 体 积 装 填 胶 体 暂 停 流 洗 X 继 续 流 洗 加上 reservoir 已 堆 积 沉 积 中 上 清 加 压 流 洗 加上 adaptor 紧 密 堆 积 检 查 好 管 柱 是 否 畅 通 1 2 Gel

19、 Gel 常用凝胶过滤介质常用凝胶过滤介质 Sephadex：交联葡聚糖交联葡聚糖，是采用环氧氯丙烷作交联剂将，是采用环氧氯丙烷作交联剂将 右旋葡聚糖交联而成。干粉容易膨胀，在水、盐溶液、右旋葡聚糖交联而成。干粉容易膨胀，在水、盐溶液、 有机溶液、碱和弱酸中化学性质稳定，可高压灭菌。有机溶液、碱和弱酸中化学性质稳定，可高压灭菌。高高 交联度交联度的的Sephadex，其颗粒坚硬，适于高流速下操作。，其颗粒坚硬，适于高流速下操作。 Sephacryl : 烯丙基葡聚糖烯丙基葡聚糖同同N、N甲叉双丙烯酰胺共甲叉双丙烯酰胺共 价交联而成。价交联而成。颗粒坚硬颗粒坚硬，性质比，性质比Sephadex更

20、为稳定，可更为稳定，可 高压灭菌，在高压灭菌，在pH311条件下稳定，可用有机溶剂洗脱，条件下稳定，可用有机溶剂洗脱， 也可用也可用SDS、尿素及盐酸胍洗脱。、尿素及盐酸胍洗脱。 Sepharose：琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶，是将琼脂糖溶液冷却，多，是将琼脂糖溶液冷却，多 糖链形成双螺旋，凝集成束，自发的形成稳定的珠状糖链形成双螺旋，凝集成束，自发的形成稳定的珠状 颗粒。琼脂糖由氢键维系，在颗粒。琼脂糖由氢键维系，在pH49条件下稳定，超条件下稳定，超 过过40熔化，冷冻出现珠状。熔化，冷冻出现珠状。 可分为可分为Sepharose 2B、 4B、6B（即含琼脂（即含琼脂2%、4%、6%）。）。

21、Sepharose CL 又称又称交联琼脂糖交联琼脂糖，是，是Sepharose 同同 2，3-二溴丙醇二溴丙醇在强在强 碱下交联而成。在碱下交联而成。在pH311条件下稳定。条件下稳定。 Sepharose Fast Flow 是经过是经过高度交联高度交联的琼脂糖珠体，的琼脂糖珠体， 大大增加了其机械强度，大大增加了其机械强度，以流速快为特征以流速快为特征。由于流速。由于流速 快，所以工业规模使用。有极高的物理化学稳定性，快，所以工业规模使用。有极高的物理化学稳定性， 可用多种有机溶剂清洗，还可用可用多种有机溶剂清洗，还可用1-2mol/L的的NaOH进进 行“原位清洗”。行“原位清洗”。

22、琼脂糖凝胶的骨架结构琼脂糖凝胶的骨架结构 交联葡聚糖凝胶的骨架结构交联葡聚糖凝胶的骨架结构 凝胶的再生和保养凝胶的再生和保养 凝胶过滤柱一般可多次使用，无需特殊的再生处理。但当多次使凝胶过滤柱一般可多次使用，无需特殊的再生处理。但当多次使 用后，凝胶可能被压紧，流速变慢。这时需要重新填装。用后，凝胶可能被压紧，流速变慢。这时需要重新填装。 葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶都是碳水化合物，能被微生物（如细菌葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶都是碳水化合物，能被微生物（如细菌 和霉菌）分解。为防止细菌生长和发酵，可用和霉菌）分解。为防止细菌生长和发酵，可用0.02%叠氮钠叠氮钠等防等防 腐剂。层析前再用缓冲液将防腐剂洗

23、去。腐剂。层析前再用缓冲液将防腐剂洗去。 保存：短期保存，可在反复洗涤除去蛋白质等杂质后，加入防腐保存：短期保存，可在反复洗涤除去蛋白质等杂质后，加入防腐 剂；长期保存，则需将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水和干燥。剂；长期保存，则需将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水和干燥。 方法是将凝胶用低浓度的酸或碱溶液短时间浸泡，再用水反复洗方法是将凝胶用低浓度的酸或碱溶液短时间浸泡，再用水反复洗 涤除去杂质，过滤抽干，浸泡在涤除去杂质，过滤抽干，浸泡在50%乙醇溶液中进行脱水。最终乙醇溶液中进行脱水。最终 浸泡在浸泡在75%乙醇中长期保存。乙醇中长期保存。 一些注意事项一些注意事项 为了提高分辨率，为了提

24、高分辨率，柱高应为柱直径的柱高应为柱直径的2040倍倍； 上样量应小于柱床体积的上样量应小于柱床体积的5%，最大不应超过柱床体积的，最大不应超过柱床体积的10%，上，上 样的蛋白质样品浓度以不超过样的蛋白质样品浓度以不超过4%为宜，浑浊样品需离心后上样。为宜，浑浊样品需离心后上样。 洗脱时，流速要恒定。缓冲液的洗脱时，流速要恒定。缓冲液的pH值、离子强度等必须都有利于值、离子强度等必须都有利于 蛋白质稳定；蛋白质稳定；中等离子强度中等离子强度的缓冲液有助于消除蛋白质与凝胶可的缓冲液有助于消除蛋白质与凝胶可 能产生的相互作用；能产生的相互作用； Sephadex在使用前需要溶胀，一份凝胶加在使用

25、前需要溶胀，一份凝胶加10份水；在摇床上或手份水；在摇床上或手 动混合，避免使用电力搅拌器；待凝胶颗粒沉降后，去除上清，动混合，避免使用电力搅拌器；待凝胶颗粒沉降后，去除上清， 重复几次，直到液相不再混浊为止；自然溶胀需重复几次，直到液相不再混浊为止；自然溶胀需24h或几天，加热或几天，加热 可促进溶胀，可促进溶胀，12h即可完成；即可完成； (2) membrane separation technique Dialysis and ultrafiltration 膜分离技术膜分离技术-微滤微滤 微滤微滤主要用于除菌过滤主要用于除菌过滤、细胞收集和产品的澄清细胞收集和产品的澄清，采用的采用的

26、 微滤微滤膜孔径为膜孔径为0.1-10m mm，适用的驱动力为适用的驱动力为0.1-0.5MPa。 采用微滤方法采用微滤方法，可做到封闭式操作可做到封闭式操作，不与环境产生交叉污不与环境产生交叉污 染染，所用设备投资少所用设备投资少，操作过程安全操作过程安全，加工量可大可小等加工量可大可小等 优点优点。 膜分离技术膜分离技术-超滤（超滤（ ultrafiltration） 超滤超滤主要用于大分子物质的分离主要用于大分子物质的分离、浓缩浓缩、除盐和改变缓冲体系等除盐和改变缓冲体系等，可分可分 离分子量从离分子量从3001,000,000Da的可溶性大分子物质的可溶性大分子物质，在以截留的浓缩液在

27、以截留的浓缩液 为产物时为产物时，可达到浓缩的目的在浓缩大分子物质时可达到浓缩的目的在浓缩大分子物质时又可同时除去无机又可同时除去无机 盐及小分子不纯物盐及小分子不纯物。 超滤膜孔径为超滤膜孔径为0.001-0.1m mm，适用的驱动力为适用的驱动力为0.2-1MPa。 超滤具有膜材料本身无毒性超滤具有膜材料本身无毒性，在操作中不溶出有害物质在操作中不溶出有害物质，故对终产品不故对终产品不 会产生不利影响会产生不利影响，可在室温或低温条件下操作可在室温或低温条件下操作，适于热敏感物质的分离适于热敏感物质的分离 浓缩；化学强度及机械损害最小浓缩；化学强度及机械损害最小，减少失活；系统可密闭循环减

28、少失活；系统可密闭循环，防止外防止外 来污染；处理效率高来污染；处理效率高，设备经济简单等优点设备经济简单等优点。 进液管进液管 封闭管封闭管 弃液管弃液管 回流管回流管 卷式超滤器卷式超滤器 中空纤维超滤器中空纤维超滤器 膜包膜包 离心沉降技术离心沉降技术 离心沉降是利用固体和液体之间的离心沉降是利用固体和液体之间的密度差密度差将两者分离将两者分离， 一般来说细胞一般来说细胞、细胞碎片细胞碎片、蛋白质沉淀物及病毒颗粒的蛋白质沉淀物及病毒颗粒的 密度都大于其相应的液体环境密度都大于其相应的液体环境，可以利用离心的方式使可以利用离心的方式使 其沉降其沉降。 沉降的难易取决于几种因素：沉降的难易取

29、决于几种因素：密度差密度差越大越大，离心沉降速离心沉降速 度越快；在密度差存在的条件下度越快；在密度差存在的条件下，分子的质量分子的质量越大越大，沉沉 降速度越快降速度越快，但但体积体积大的分子出于阻力大大的分子出于阻力大，会影响其沉会影响其沉 降速度；降速度；液体的粘稠度液体的粘稠度越大越不容易离心越大越不容易离心。 (3) Density gradient centrifugation Sedimentation coefficient (s)Sedimentation coefficient (s)-单位离心力的沉降速度单位离心力的沉降速度 s = dx/dt /s = dx/dt /2

30、 2r 1S (Svedberg) =10r 1S (Svedberg) =10- -13 13 秒 秒 离心沉降技术离心沉降技术 离心机按转速可分为：离心机按转速可分为：普通离心机普通离心机(500一一4000rpm)、高速离心机高速离心机 (800一一25000rpm)、超速离心机超速离心机(2500080000rpm)和超高速离心和超高速离心 机机(150000rpm)。分子量大于分子量大于108者可用高速和普通离心机者可用高速和普通离心机， 106- 108者应选用超速离心机者应选用超速离心机，而小于而小于106者用离心效果不好者用离心效果不好。 利用离心机分离物质主要采用两种方式：利

31、用离心机分离物质主要采用两种方式：沉降速度法沉降速度法和和沉降平衡沉降平衡 法法。 离心沉降技术离心沉降技术 沉降速度法沉降速度法 主要用于分离主要用于分离沉降系数不同沉降系数不同(相差达一个数量相差达一个数量 级以上级以上)的物质的物质，这种方法采用这种方法采用差速离心差速离心，逐步分级增大离逐步分级增大离 心力心力，开始在一个较低的速度下离心开始在一个较低的速度下离心，使可溶物和不溶物使可溶物和不溶物 分开分开，取上清后加大离心速度取上清后加大离心速度，使某些沉降系数大的物质使某些沉降系数大的物质 沉淀沉淀，然后再次去上清然后再次去上清，加大离心力加大离心力，再次获得另一种物再次获得另一种

32、物 质沉淀质沉淀，如此反复多次如此反复多次，使不同物质按沉降系数不同逐级使不同物质按沉降系数不同逐级 分开分开。 离心沉降技术离心沉降技术 沉降平衡法沉降平衡法 当两种物质的当两种物质的沉降系数差别不到一个数量级沉降系数差别不到一个数量级 时时，用沉降速度法很难分开用沉降速度法很难分开，这时要借助于沉降平衡法来这时要借助于沉降平衡法来 获得比较满意的分离效果获得比较满意的分离效果，常用的为常用的为密度梯度离心法密度梯度离心法。这这 种方法的原理是人为造成离心管中不同的密度环境种方法的原理是人为造成离心管中不同的密度环境，使介使介 质的最大密度大于分离物的最大密度质的最大密度大于分离物的最大密度

33、，这样分离物在离心这样分离物在离心 力的作用下力的作用下，各自停留在与其密度相当的区域各自停留在与其密度相当的区域，从而达到从而达到 分离的目的分离的目的，这一方法的要点是这一方法的要点是离心时间要足够离心时间要足够，离心后离心后 分层收集分层收集。 (3) Density gradient centrifugation 台式离心机台式离心机 大容量离心机大容量离心机 超速离心机超速离心机 超高速离心机超高速离心机 3. Purification methods according to difference of charge (1) Ion exchange chromatography：

34、 (2) Polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE） (3) Isoelectric focusing electrophoresis（IEF）：）： (1) Ion exchange chromatography 离子取代优先顺序离子取代优先顺序 + + + + + + + + + + + + + + + + + 电荷高者 离子大者 浓度大者 离子交换层析类型离子交换层析类型 强酸型：磺乙基、磺丙基强酸型：磺乙基、磺丙基 阳离子交换树脂阳离子交换树脂 中酸型：磷酸基中酸型：磷酸基 弱酸型：羧甲基弱酸型：羧甲基 强碱型：三乙基氨基乙基、强碱型：三乙基氨基乙

35、基、 阴离子交换树脂阴离子交换树脂 二乙基（二乙基（2羟丙基）羟丙基）氨基乙基氨基乙基 中强碱型：二乙基氨基乙基中强碱型：二乙基氨基乙基 弱碱型：氨基乙基、对氨基苯甲基弱碱型：氨基乙基、对氨基苯甲基 蛋白质纯化常用的离子交换剂蛋白质纯化常用的离子交换剂 蛋白质纯化常用蛋白质纯化常用亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂。因为亲水性离子交换。因为亲水性离子交换 剂对生物大分子物质的吸附和洗脱均较温和，被分离纯化剂对生物大分子物质的吸附和洗脱均较温和，被分离纯化 的物质不易被破坏。的物质不易被破坏。 纤维素类纤维素类：纤维素离子交换剂是最早用于生物大分子分离：纤维素离子交换剂是最早用于生物大分子分离 的

36、介质，它具有松散的亲水网络，大孔隙、表面积大等优的介质，它具有松散的亲水网络，大孔隙、表面积大等优 点。但因以无定型为主，故很难用于层析柱操作。点。但因以无定型为主，故很难用于层析柱操作。DEAE- Sephacel 是经特殊交联处理制成的珠状离子交换纤维素。是经特殊交联处理制成的珠状离子交换纤维素。 蛋白质纯化常用的离子交换剂蛋白质纯化常用的离子交换剂 葡聚糖系离子交换介质葡聚糖系离子交换介质：主要以：主要以Sephadex系的产品为主，系的产品为主， 它是在它是在Sephadex G25及及G50两种凝胶过滤介质上引入功能两种凝胶过滤介质上引入功能 基后，产生的多种离子交换介质。该类介质容

37、量大，价格基后，产生的多种离子交换介质。该类介质容量大，价格 较低，但由于流速、体积受外界影响较大，逐渐被新一代较低，但由于流速、体积受外界影响较大，逐渐被新一代 的的BioProcess凝胶所代替。凝胶所代替。 琼脂糖系琼脂糖系（agarose)：琼脂糖凝胶介质上引入功能基得到的：琼脂糖凝胶介质上引入功能基得到的 多种离子交换剂。其中，新一代多种离子交换剂。其中，新一代BioProcess系列凝胶，具有系列凝胶，具有 流速高，载量大，理化稳定性好，可就地清洗，并可反复流速高，载量大，理化稳定性好，可就地清洗，并可反复 使用，是目前使用最多的离子交换介质。使用，是目前使用最多的离子交换介质。

38、Test-tube methods for selecting ion exchange conditions (2) SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） Monomer：Acrylamide，Methylenebisacrylamide; Accelerator：TEMED （N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine）; Initiator：Ammonium Persulfate； Denaturant：SDS； Reductant：-Mercaptoethanol; Staining：1. Coom

39、assie brilliant blue G-250 2. Silver staining SDSPAGE logM = K1K2R (3) Isoelectric focusing electrophoresis （IEF） （） （） （+） （+） Principle of IEF 10 or 20 Fractions Ampholytes generate pH gradient (pH 3-10) 7.5 9.5 7.5 pI 4.5 7.5 7.5 7.5 pI 4.5 9.5 9.5 9.5 9.5 pI 4.5 3 4 5 6 7 8 9 10 Anode (+) Cathod

40、e (-) ACID BASE Proteins Migrate to their pI ( 0 net charge) Principle of IEF 10 or 20 Fractions Harvest with Vacuum Source 7.5 9.5 7.5 pI 4.5 7.5 7.5 7.5 pI 4.5 9.5 9.5 9.5 9.5 pI 4.5 3 4 5 6 7 8 9 10 Anode (+) Cathode (-) ACID BASE 2-D electrophoresis Condition A Condition B 3 4 7 10 pH + - - + SA

41、MPLE PREPARATION FIRST DIMENSION SECOND DIMENSION STAINING IMAGING ANALYSIS & EXTRACTION MASS SPECTROMETRIC IDENTIFICATION OF SPOTS 2-D Expression Proteomics Methodology Types of proteins Proteomics - study of large sets of proteins, such as the entire complement of proteins produced by a cell E. co

42、li has about 4000 different polypeptides (average size 300 amino acids, Mr 33,000) Fruit fly (Drosophila melanogaster) about 16,000, humans, other mammals about 40,000 different polypeptides 4. Purification methods according to interaction of a protein with other compounds (1) Affinity chromatograph

43、y ： (2) Adsorption : (3) Hydrophobic interaction chromatography (HIC): 固相载体 (1) (2) (3) A B Sample Washing Elution X B 亲和基团 配体 X B A A （1）Affinity chromatography Typical affinity purification 金属螯合亲和层析金属螯合亲和层析，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基 酸，例如酸，例如: :组氨酸等能够与多种过渡金属离子如：组氨酸等能够与多种过渡金属离子如：NiNi2+ 2+， ，

44、 CuCu2+ 2+， ，ZnZn2+ 2+， ，CoCo2+ 2+， ，FeFe3+ 3+发生特殊的相互作用，利用这个原理 发生特殊的相互作用，利用这个原理 对蛋白质加以分离。因此偶联了合适金属离子的琼脂糖凝对蛋白质加以分离。因此偶联了合适金属离子的琼脂糖凝 胶就能够选择性的吸附那些含有胶就能够选择性的吸附那些含有组氨酸的蛋白组氨酸的蛋白和对金属离和对金属离 子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸 也能与固定金属离子产生结合作用，但这种结合力要远小也能与固定金属离子产生结合作用，但这种结合力要远小 于组氨酸残基与金属离子的结合力。

45、于组氨酸残基与金属离子的结合力。 (2) Adsorption -羟基磷灰石羟基磷灰石 （3）疏水作用层析）疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC） 疏水作用层析是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物疏水作用层析是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物 大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴 露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁疏水补丁，疏水补丁可，疏水补丁可 以与疏水

46、性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性 不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层 析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。 疏水作用层析流程疏水作用层析流程 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Results of purification and purity 总蛋白，总活力，比活总蛋白，总活力，比活 力，纯化倍数（以比活力，纯化倍数（以比活 力计算），回收率（以力计算），回收率（以 总活力计算）。总活力计算）。