第四章蛋白质与酶的化学修饰课件.pptx

1、第四章 蛋白质与酶的化学修饰4.14.1、概述、概述4.24.2、化学修饰的设计、化学修饰的设计4.34.3、化学修饰的种类、化学修饰的种类4.44.4、修饰酶的性质及特点、修饰酶的性质及特点4.54.5、化学修饰的应用、化学修饰的应用4.64.6、化学修饰的局限性、化学修饰的局限性4.14.1、概述、概述目前为止尽管人类已经发现了数千种酶目前为止尽管人类已经发现了数千种酶,但是真正具有商业价值即每年销售额可超但是真正具有商业价值即每年销售额可超过过10001000万美元的酶不过数十万美元的酶不过数十种种,为什么？为什么？一、限制酶的应用的原因一、限制酶的应用的原因 1 1、稳定性不够，不能适

2、应大量生产的需要、稳定性不够，不能适应大量生产的需要。2 2、作用的最适条件不符。、作用的最适条件不符。3 3、酶的专一性、酶的专一性4 4、米式常数过大、米式常数过大5 5、临床应用的特殊要求、临床应用的特殊要求6 6、酶活性不够高、酶活性不够高二、改变酶特性有两种主要的方法二、改变酶特性有两种主要的方法1)1)通过化学修饰的方法来改变已分离出来通过化学修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。的天然酶的活性。2)2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。因而达到改造酶的目的。三、酶化学修饰的概念三、酶化学修饰的概念 酶的化学修饰（酶的化学

3、修饰（chemical modificationchemical modification）：）：通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。结构发生改变。酶选择性化学修饰：酶选择性化学修饰：描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。四、酶化学修饰的目的四、酶化学修饰的目的1.1.研究酶的结构与功能的关系。研究酶的结构与功能的关系。（5050年代末）年代末）2.2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。范围。（7070年代末之后）年代末之后）1 1）提高酶的生物活性（

4、酶活力）。）提高酶的生物活性（酶活力）。2 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。）。4 4）产生新的催化能力。）产生新的催化能力。五、酶五、酶化学修饰化学修饰的原理的原理1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化

5、学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除；“遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合。5、酶微环境稳定的维持pH值改变时：破坏了酶分子上静电形成的化学键，氢键等维持天然构象的平衡力改变了酶分子上氨基酸残基的离解状态和它们之间的相互结合及作用方式许多大分子修饰剂本身就是多聚电解质，能在酶分子表面或微环境区域形成一 层“缓冲外壳”。4.2、化学修

6、饰的设计一、酶性质的了解一、酶性质的了解（1）酶的稳定性）酶的稳定性热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等抑制剂等（2）酶活性中心的状况）酶活性中心的状况活性中心基团、辅因子等。其他如分子大活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等小、性状、亚基数等（3）酶侧链基团的性质及其反应性）酶侧链基团的性质及其反应性巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、二硫键、硫醚基等、胍基、吲哚基、二硫键、硫醚基等 二、修饰剂的要求 1、修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性2、修饰剂上反应基团的数目及位置

7、3、修饰剂上反应基团的活化方法与条件一般要求较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多反应活性基团；试剂的选择要根据修饰目的选择例如对氨基修饰可有几种情况 修饰所有氨基而不修饰其它基团；仅修饰-氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基；修饰具有催化活性的氨基；例：如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，则必须选择能引入 最大电荷量的试剂。用于修饰酶的氨基酸残基的试剂应具备：选择性地与一个氨基酸残基反应；反应在酶蛋白不变性条件下进行；所标记的残基在肽链中稳定以易于分离鉴定；修饰反应的程度能简单测定；三、反应条件的选择三、反应条件的选择 修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量修饰反应尽

8、可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。酶的活力回收高。（1）pH与离子强度与离子强度pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2）修饰反应的温度与时间）修饰反应的温度与时间严格控制温度和时间可以减少以至消除一些严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。非专一性的修饰反应。（3）反应体系中酶与修饰剂的比例）反应体系中酶与修饰剂的比例四、四、化学修饰化学修饰的影响因素的影

9、响因素 有有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学生物学活性活性(称称非必需部分的修饰非必需部分的修饰);但大多情但大多情况下将导致生物活性的改变况下将导致生物活性的改变(如下降以至完全丧如下降以至完全丧失失)。影响蛋白质化学修饰反应进程的因素：影响蛋白质化学修饰反应进程的因素：1.蛋白质功能基的反应性；蛋白质功能基的反应性；2.修饰剂的反应性。修饰剂的反应性。一）、蛋白质功能基反应性的影响因素一）、蛋白质功能基反应性的影响因素蛋白质的修饰反应都是亲核反应。被蛋白质的修饰反应都是亲核反应。被修饰蛋白质修饰蛋白质侧链基团的亲核性与其侧链基团的亲核性与其

10、pKpK值相关值相关。影响蛋白质侧链基团影响蛋白质侧链基团pKpK值的因素有值的因素有 1 1、微环境：微区极性、基团间的氢键、静电相互作用、微环境：微区极性、基团间的氢键、静电相互作用2 2、基团之间的障碍（位阻效应）、基团之间的障碍（位阻效应）3 3、其它因素：电荷转移、共价键形成、金属螯合、旋转、其它因素：电荷转移、共价键形成、金属螯合、旋转自由度等自由度等二）、蛋白质二）、蛋白质功能基的超反应性功能基的超反应性 超反应性超反应性：指蛋白质的某个侧链基团与个别试剂：指蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应。能发生非常迅速的反应。酶的催化活性基团通常对修饰剂是有反应的，但酶的催

11、化活性基团通常对修饰剂是有反应的，但酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团，酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团，可能与酶的功能或构象没有明显联系。可能与酶的功能或构象没有明显联系。三）、修饰三）、修饰剂反应性的决定因素剂反应性的决定因素1.选择性吸附选择性吸附：化学修饰前，修饰剂根据各自的：化学修饰前，修饰剂根据各自的特点，选择性地吸附于低或高极性区的，有时特点，选择性地吸附于低或高极性区的，有时可以根据对速度的饱和效应，检测出蛋白质可以根据对速度的饱和效应，检测出蛋白质-修修饰剂复合物的形成，类似酶饰剂复合物的形成，类似酶-底物复合物。底物复合物。2.静电相互作用静电相互作用：带电的

12、修饰剂能选择性地吸引：带电的修饰剂能选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位。该作用可使到蛋白质表面带相反电荷的部位。该作用可使修饰剂向多功能部位中的一个残基定位，或向修饰剂向多功能部位中的一个残基定位，或向双功能基一侧定位。此外，静电排斥力能抑制双功能基一侧定位。此外，静电排斥力能抑制修饰作用。修饰作用。3.位阻因素位阻因素：蛋白质表面的位阻因素，或底物、：蛋白质表面的位阻因素，或底物、辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都能阻止修辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都能阻止修饰剂与功能基的正常反应。但修饰的结果却能饰剂与功能基的正常反应。但修饰的结果却能提供蛋白质表面的有用信息。提供蛋白质表面的有用信

13、息。4.催化因素催化因素：修饰部位附近的其它功能基，若起：修饰部位附近的其它功能基，若起一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。5.局部环境的极性局部环境的极性：许多有机反应的速度与溶剂：许多有机反应的速度与溶剂的极性有关，而有些反应则与极性无关；疏水的极性有关，而有些反应则与极性无关；疏水环境能阻止产物中电荷分离的反应。环境能阻止产物中电荷分离的反应。4.34.3、化学修饰的种类、化学修饰的种类一一表面修饰表面修饰二二内部修饰内部修饰三三与辅因子相关的修饰与辅因子相关的修饰四四物理修饰物理修饰 五五亲和修饰亲和修饰一、一、表面修饰表面修饰1.化学固定化化学

14、固定化2.小分子修饰小分子修饰3.大分子修饰大分子修饰4.肽链的交联肽链的交联1、化学固定化 通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价连接到惰性载体上，从而改变酶所处的环境，酶的性质也相应发生改变。例如：酶固定到电荷载体上，由于介质中的质子靠近载体，并与载体上的电荷 发生作用，使酶的最适pH发生偏移。糖化酶固定到阴离子载体上，最适pH4.5升到6.5，与D-木糖异构酶的最适pH7.5 靠近，可简化高果糖浆生产工艺。载体与底物带相同电荷，固定化后反应系统Km增加，反之，Km降低。增加酶分子构象稳定性。2.小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）定义：定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子通过选择性

15、的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团：侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。侧链基团修饰剂：侧链基团修饰剂：采用各种小分子化合物。采用各种小分子化合物。2020种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。几种重要的修饰反应：几种重要的修饰反应：烷基化反应烷基化反应酰化反应酰化反应氧化还原反应氧化还原

16、反应芳香环取代反应芳香环取代反应 1)1)烷基化反应烷基化反应 试剂特点：试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如的亲核基团（如NHNH2 2，-SH-SH等）发生烷基化。等）发生烷基化。可作用基团：可作用基团：氨基（氨基（LysLys，ArgArg），巯基（），巯基（CysCys），羧基（），羧基（AspAsp、GluGlu），甲硫基（），甲硫基（MetMet），咪唑基（），咪唑基（HisHis）。）。修饰剂：修饰剂：2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。酰胺等。烷基化反应 2)2)酰基化反应酰基化反应 试剂特点：试剂特

17、点：含有含有 结构，作用于侧链基团结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。上的亲核基团，使之酰基化。可作用基团：可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（氨基，巯基，醇羟基（SerSer、ThrThr），），酚羟基（酚羟基（TyrTyr）酰基化反应 3)3)氧化和还原反应氧化和还原反应试剂特点：试剂特点：具有氧化性或还原性。具有氧化性或还原性。氧化剂：氧化剂：H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，）、咪唑基，酚基等。酚基等。还原剂：还原剂：2巯基乙醇、巯基乙醇、DTT等。等。可被还原的侧链基团

18、：可被还原的侧链基团：二硫键。二硫键。连四硫酸盐氧化巯基，连四硫酸盐氧化巯基，DTTDTT还原逆回，用于保护巯基。还原逆回，用于保护巯基。4)4)芳香环取代反应芳香环取代反应试剂：卤（碘）化，硝化试剂。试剂：卤（碘）化，硝化试剂。碘代：碘代：I2 +HI 硝化：硝化：(NO2)4C+(NO2)3CH （四硝基甲烷）（四硝基甲烷）特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰氨基修饰（氨基修饰（Lys）羧基修饰（羧基修饰（Asp、Glu）巯基修饰（巯基修饰（Cys）胍基修饰（胍基修饰（Arg）羟基修饰（羟基修饰（Ser、Thr、Tyr）咪唑基修饰（咪唑基修饰（His）吲哚基修饰

19、（吲哚基修饰（Trp）甲硫基修饰（甲硫基修饰（Met）二硫键修饰二硫键修饰亲和修饰亲和修饰 1）、）、氨基（氨基（NH2）修饰）修饰 氨基在酶蛋白中主要是氨基在酶蛋白中主要是 和肽和肽链末端氨基链末端氨基的的 -NH2 亲核反应活性很高，易亲核反应活性很高，易被选择性修饰被选择性修饰 一般情况下一般情况下 -NH2 的的 pKa=10，其解离程，其解离程度取决于微环境度取决于微环境 氨基的修饰反应主要有氨基的修饰反应主要有N-烷基化等烷基化等乙酸酐乙酸酐 2,4,6-三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸(TNBS)2,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)碘代乙酸碘代乙酸(IAA)还原还原烷基化烷基化醛醛

20、丹磺酞氯丹磺酞氯(DNS)乙酰化乙酰化电荷消失电荷消失芳基化芳基化电荷消失电荷消失芳基化芳基化电荷消失电荷消失烷基化烷基化引入负电荷引入负电荷芳基化芳基化电荷消失电荷消失引入正电荷引入正电荷 2）、）、修饰修饰 羧基在酶蛋白中主要是羧基在酶蛋白中主要是，以及肽链的末端羧基，以及肽链的末端羧基 在水溶液中，在水溶液中，COOH 通常解离成通常解离成，亲核性降低，对其修饰的方法有限，主要反亲核性降低，对其修饰的方法有限，主要反应为成酯、成酰胺反应应为成酯、成酰胺反应 修饰反应修饰反应 R,R为烷基；为烷基；X为卤素为卤素碳二亚胺碳二亚胺 修饰反应修饰反应 羧基羧基 酯化反应酯化反应硼氟化三甲洋盐硼

21、氟化三甲洋盐甲醇甲醇胃蛋白酶与胃蛋白酶与14C硼氟硼氟化三甲洋盐在化三甲洋盐在pH 5时时酶完全酶完全失活，研究失活，研究表表明两明两-COOH为该酶为该酶必需基团必需基团 3）、）、修饰修饰 巯基在酶蛋白中的来源巯基在酶蛋白中的来源是是 巯基的巯基的，往往是酶分子中反应活性最，往往是酶分子中反应活性最高的基团高的基团 巯基容易被氧化成巯基容易被氧化成，在维持蛋白亚，在维持蛋白亚基之间的相互作用和酶催化过程中起重要作用基之间的相互作用和酶催化过程中起重要作用 巯基用烷基化试剂修饰后一般能得到稳定的修巯基用烷基化试剂修饰后一般能得到稳定的修饰产物饰产物 修饰反应修饰反应 常用于定量测定蛋白质分子

22、常用于定量测定蛋白质分子-SH数目、研究数目、研究-SH的改变程度和的改变程度和-SH所处的环境所处的环境。4,4-二硫二吡啶（二硫二吡啶（4-PDS）5,5-二硫二硫-2-硝基苯甲酸硝基苯甲酸(DTNB)又称又称Ellman试剂试剂412 nm处处有有强强吸收吸收324 nm处处有吸收有吸收TNB 修饰反应修饰反应 对氯汞苯甲酸对氯汞苯甲酸(PMB)2-氯汞氯汞-4-硝基苯酚硝基苯酚(MNP)250 nm处有处有最大光吸收最大光吸收可容许低浓度蛋白质的光可容许低浓度蛋白质的光谱定量分析谱定量分析 修饰反应修饰反应 N一乙基马来酰亚胺一乙基马来酰亚胺(NEM)碘代乙酸碘代乙酸(IAA)同时会使

23、氨基乙酰化同时会使氨基乙酰化300 nm处处有最大光有最大光吸收吸收 4）胍基（胍基（N=C(NH2)2）修饰）修饰 胍基存在于酶蛋白的胍基存在于酶蛋白的 侧链上侧链上 在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起重要作用重要作用 胍基碱性强，难以和大多数试剂反应，一般胍基碱性强，难以和大多数试剂反应，一般采用具有采用具有两个邻位羰基两个邻位羰基的化合物，在中性或的化合物，在中性或弱碱性条件下反应，一般是可逆反应弱碱性条件下反应，一般是可逆反应 修饰反应修饰反应 胍基胍基（与邻二酮的反应）（与邻二酮的反应）丁二酮丁二酮硼酸盐硼酸盐1,2-环己二酮环己二酮硼酸盐硼

24、酸盐苯乙二醛苯乙二醛需在黑暗中进行需在黑暗中进行,因其可作为光因其可作为光敏剂破坏敏剂破坏TrpHisTyr等残基等残基 5）、酚基和羟基（）、酚基和羟基（OH）修饰）修饰 酶蛋白中含羟基的氨基酸残基有：酶蛋白中含羟基的氨基酸残基有：Ser、Thr、Tyr 羟基的羟基的，通常修饰剂能，通常修饰剂能同时修饰羟基、氨基和巯基同时修饰羟基、氨基和巯基相比于相比于 Ser 和和 Thr 的羟基要的羟基要活泼一些，更容易发生修饰；酚基具有芳活泼一些，更容易发生修饰；酚基具有芳香性，能发生亲电取代反应香性，能发生亲电取代反应 修饰反应修饰反应 酚基和酚羟基酚基和酚羟基 酚基亲电取代反应酚基亲电取代反应碘化

25、反应碘化反应四硝基甲烷四硝基甲烷(TNM)修饰反应修饰反应 （酚）羟基（酚）羟基 O-酰基化反应酰基化反应N-乙酰咪唑乙酰咪唑二异丙基氟磷酸二异丙基氟磷酸(DFP)6）、）、咪唑基修饰咪唑基修饰 咪唑基存在于酶蛋白的咪唑基存在于酶蛋白的 His 残基残基侧链上侧链上 His 是多种酶的活性中心，是电荷中继网中是多种酶的活性中心，是电荷中继网中的重要成员的重要成员 对对 His 咪唑基的修饰，一般是通过咪唑基的修饰，一般是通过 N-烷基烷基化或化或 C-亲核取代来进行亲核取代来进行 对咪唑进行修饰后，酶活性一般会受到显对咪唑进行修饰后，酶活性一般会受到显著影响著影响 修饰反应修饰反应 咪唑基咪唑

26、基 N-取代反应取代反应焦碳酸二乙醋（焦碳酸二乙醋（DPC）碘乙酸碘乙酸DPC是最常用的是最常用的His残基的残基的修饰试剂修饰试剂,，使使His残基的咪残基的咪唑基上唑基上1个个N羧乙基化羧乙基化,并使并使得在得在240nm处的光吸收增加。处的光吸收增加。在碱性条件下该取代反应是在碱性条件下该取代反应是可逆的。可逆的。修饰反应修饰反应 咪唑基咪唑基 杂环上的亲电取代反应杂环上的亲电取代反应碘化反应碘化反应 7）、吲哚基修饰）、吲哚基修饰 吲哚基存在于酶蛋白的吲哚基存在于酶蛋白的 侧链上侧链上 Trp 残基疏水性较强，一般位于酶分子的残基疏水性较强，一般位于酶分子的内部，反应活性比氨基和巯基差

27、，因此对内部，反应活性比氨基和巯基差，因此对其修饰较困难，很多能与吲哚基反应的试其修饰较困难，很多能与吲哚基反应的试剂，一般优先与巯基或氨基反应。剂，一般优先与巯基或氨基反应。有时候有时候 Tyr 会对吲哚基的修饰产生干扰会对吲哚基的修饰产生干扰 修饰反应修饰反应 吲哚基吲哚基 与与 Koshland 试剂的反应试剂的反应水溶性差水溶性差,使修饰反应较难进行使修饰反应较难进行410nm有光吸收有光吸收,可测定修饰程度可测定修饰程度或或Trp残基定量残基定量2-羟基羟基-5-硝基苄基硝基苄基或或Koshland试剂试剂(HNBB)4一硝基苯硫氯一硝基苯硫氯这些试剂也非常容易与巯基作用，因此修饰色

28、氨酸残基这些试剂也非常容易与巯基作用，因此修饰色氨酸残基时需要对巯基进行保护。时需要对巯基进行保护。8）、）、甲硫基修饰甲硫基修饰 酶蛋白中酶蛋白中 中的硫以硫醚的形式存中的硫以硫醚的形式存在在 硫醚中的硫原子虽然具有亲核性，但反应硫醚中的硫原子虽然具有亲核性，但反应活性较差，在温和的条件下一般不发生反活性较差，在温和的条件下一般不发生反应应 硫醚的主要反应主要是氧化反应，产物为硫醚的主要反应主要是氧化反应，产物为砜和亚砜；另外，采用某些试剂也可以进砜和亚砜；另外，采用某些试剂也可以进行行 S-烷基化反应烷基化反应 修饰反应修饰反应 甲硫基甲硫基 过氧化氢过氧化氢过甲酸过甲酸碘乙酰胺碘乙酰胺9

29、）、二硫键的修饰）、二硫键的修饰同同-SH类似类似,-S-S-具有其特有的特性具有其特有的特性,可用来进行特可用来进行特异的修饰异的修饰,通常是通过还原的方法通常是通过还原的方法.这些方法通常与某这些方法通常与某些些-SH修饰方法结合修饰方法结合,以阻止再氧化成以阻止再氧化成-S-S-或计算断裂或计算断裂开的开的-S-S-数目。数目。常用的有常用的有:巯基乙醇巯基乙醇(具高度选择性和长的半衰期具高度选择性和长的半衰期.但要有变性剂但要有变性剂,且使用大大过量的巯基乙醇且使用大大过量的巯基乙醇)、Cleland 试剂包括二硫苏糖醇试剂包括二硫苏糖醇(DTT)及其差向异构体二硫赤藓糖及其差向异构体

30、二硫赤藓糖醇醇(DTE)(勿需过量还原剂勿需过量还原剂)。-S-S-经还原成为经还原成为-SH，一般情况下很容易自动氧化，一般情况下很容易自动氧化，故需经过羧甲基处理防止重新氧化。，故需经过羧甲基处理防止重新氧化。氨基酸侧链基团修饰剂Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、乙酸酐、醛Asp、Glu羧基水溶性碳化二亚胺、硼氟化三甲洋盐、甲醇Arg胍基苯乙二醛，1,2环己二酮、丁二酮Cys巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺二硫键巯基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺Met硫醚基碘乙酰胺 各种氨基酸

31、侧链的修饰剂各种氨基酸侧链的修饰剂 解释修饰效果须十分小心，因为：解释修饰效果须十分小心，因为：任何一种修饰剂任何一种修饰剂不是绝对专一不是绝对专一的。的。有些修饰剂有些修饰剂引起蛋白质构象变化引起蛋白质构象变化失失活，活，不一定是活性中心基团被共价修饰。不一定是活性中心基团被共价修饰。不同部分的相同基团，修饰效果不同不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。分子内部的必需基团，不易被修饰。10）、亲和修饰）、亲和修饰 亲和修饰，酶的专一性修饰亲和修饰，酶的专一性修饰 用于酶化学修饰的试剂，即使对某一基团反应是用于酶化学修饰的试剂，即使对某一基团反应是专一的，也仍然有多

32、个同类残基与之反应，因此专一的，也仍然有多个同类残基与之反应，因此对某个特定残基的选择性修饰比较困难，为了解对某个特定残基的选择性修饰比较困难，为了解决此问题，开发了亲和标记试剂决此问题，开发了亲和标记试剂 这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂，一般具有这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂，一般具有与底物相似的结构，对酶活性部位具有高度的亲与底物相似的结构，对酶活性部位具有高度的亲和性和性，可专一性标记于酶的活性中心上，使酶不，可专一性标记于酶的活性中心上，使酶不可逆失活，因此也称可逆失活，因此也称专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂 亲和标记试剂的特点亲和标记试剂的特点 在使酶不可逆失活以前，要与酶

33、形成在使酶不可逆失活以前，要与酶形成可逆复可逆复合物合物 亲和试剂的修饰程度是有限的亲和试剂的修饰程度是有限的 竞争性类似物的存在会降低修饰反应速率竞争性类似物的存在会降低修饰反应速率 亲和试剂体积不能太大，否则造成较大的空亲和试剂体积不能太大，否则造成较大的空间位阻间位阻 修饰产物应当稳定，应便于表征和定量修饰产物应当稳定，应便于表征和定量 KS 型（竞争性标记试剂）型（竞争性标记试剂）根据底物的结构设计的，具有与底物根据底物的结构设计的，具有与底物的的结合基团，同时还具有能与酶活性部位结合基团，同时还具有能与酶活性部位氨基酸侧链反应的活性基团氨基酸侧链反应的活性基团 特点特点 底物、竞争性

34、抑制剂及其他结构类似物对修饰具底物、竞争性抑制剂及其他结构类似物对修饰具有保护作用有保护作用 修饰反应是定量定点进行的修饰反应是定量定点进行的 Kcat 型（自杀性标记试剂）型（自杀性标记试剂）根据酶催化过程设计，专一性很高根据酶催化过程设计，专一性很高 具有酶的底物性质，还有一个具有酶的底物性质，还有一个的反应基的反应基团在酶催化下团在酶催化下，与酶活性部位氨基酸侧，与酶活性部位氨基酸侧链发生反应，不可逆地结合链发生反应，不可逆地结合3.大分子修饰（大分子结合修饰）是目前是目前应用最广应用最广的酶分子修饰方法。的酶分子修饰方法。（1 1）定义）定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发

35、利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。（2 2）修饰剂：）修饰剂：聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）、右旋糖酐（）、右旋糖酐（dextrandextran）、肝素（）、肝素（heparinheparin）、蔗糖聚合物（）、蔗糖聚合物（FicollFicoll）等。）等。修饰方法：非共价修饰、共价修饰。修饰方法：非共价修饰、共价修饰。非共价修饰非共价修饰 使用一些能与酶使用一些能与酶非共价非共价地相互作用而又地相互作用而又能有效地保护酶的一些能有效地保护酶的一些添加物添加物，如聚乙二醇，如聚乙二醇

36、、右旋糖苷等，它们既能通过、右旋糖苷等，它们既能通过氢键氢键固定在酶固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。连，从而保护酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来 保护酶的活力。保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。定性也就增加了。共

37、价修饰共价修饰 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过、肝素等，通过共价键共价键连接于酶分子的表面，连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。形成一层覆盖层。大分子修饰大分子修饰(共价共价)的过程的过程修饰剂的选择修饰剂的选择修饰剂的活化修饰剂的活化修饰蛋白质修饰蛋白质将修饰剂与蛋白分离将修饰剂与蛋白分离1）聚乙二醇及其修饰反应）聚乙二醇及其修饰反应 聚乙二醇的特点：聚乙二醇的特点：线性线性分子分子(HO-CH2-CH2-O-CH2)n-CH2-OH；具有良好的具有良好的生物相容性和水溶性生物相容性和水溶性；在体内在体内无毒性、无残留、无免疫原性无毒性

38、、无残留、无免疫原性；末端活化后末端活化后可与酶产生交联可与酶产生交联；覆盖在酶分子表面形成疏松的覆盖在酶分子表面形成疏松的亲水外壳亲水外壳，导致流体动，导致流体动力学发生改变。力学发生改变。聚乙二醇作为修饰剂应注意的问题：聚乙二醇作为修饰剂应注意的问题：PEG分子量为分子量为7505000的修饰效果较好，的修饰效果较好，用用甲氧基甲氧基PEG效果更好；效果更好；修饰效果还与所用修饰效果还与所用活化剂与酶的配比活化剂与酶的配比有关有关，PEG:E=1550:1 40%活力保持。活力保持。应尽量选择应尽量选择对酶活性影响小对酶活性影响小的修饰方法。的修饰方法。修饰反应修饰反应 叠氮法叠氮法 将将

39、PEG的末端的末端羟基转化为叠氮基羟基转化为叠氮基，然后与酶反应。，然后与酶反应。琥珀酸酐法琥珀酸酐法 用二溴代琥珀酸酐在温和碱性条用二溴代琥珀酸酐在温和碱性条件下将件下将PEG活化，经减压浓缩得活化活化，经减压浓缩得活化PEG，可，可与酶分子上氨基交联与酶分子上氨基交联。三氯均嗪法三氯均嗪法 PEG经三氯均嗪法活化后，用石油醚经三氯均嗪法活化后，用石油醚抽提或减压蒸馏，制得活化抽提或减压蒸馏，制得活化PEG。羰二亚胺法羰二亚胺法 修饰酶分子上的羧基修饰酶分子上的羧基 重氮法重氮法 将将PEG末端羟基转换成重氮基团，再末端羟基转换成重氮基团，再在在弱碱性弱碱性条件下修饰酶分子中的酚基、咪条件下

40、修饰酶分子中的酚基、咪唑基。唑基。2）糖类的修饰反应）糖类的修饰反应 溴化氰法溴化氰法 右旋糖苷经溴化氰活化后，在碱性右旋糖苷经溴化氰活化后，在碱性条件下与酶的游离氨基共价连接，生成条件下与酶的游离氨基共价连接，生成修饰酶。修饰酶。高碘酸氧化法高碘酸氧化法 高碘酸将右旋糖苷上邻双羟基氧化高碘酸将右旋糖苷上邻双羟基氧化成醛基，醛基再与酶分子上的氨基结合成醛基，醛基再与酶分子上的氨基结合而生成修饰酶。而生成修饰酶。4、肽链交联、肽链交联采用双功能基团化合物（双功能试剂），在采用双功能基团化合物（双功能试剂），在酶分子中对酶分子中对空间距离较近空间距离较近 的两个氨基酸残基侧的两个氨基酸残基侧链基团

41、之间进行共价交联链基团之间进行共价交联 双功能试剂：指具有两个反应活性部位，分为同型双功能交联剂和异型双功能交联剂，可在相隔较近的两个氨基酸残基间搭桥、形成多肽链内、链间或蛋白质分子间的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。双功能试剂还可将一蛋白质分子偶联到一个化学惰性的水不溶性的生物大分子上，形成固定化蛋白质。表征交联在一起的氨基酸残基或蛋白质，可提供许多关于蛋白质构象和蛋白质间相互作用的信息。侧链基团修饰侧链基团修饰 分子内交联试剂分子内交联试剂 同型、异型同型、异型 可裂解、不可裂解可裂解、不可裂解 分子内交联分子内交联 增加酶分子表面交联键的数目。增加酶分子表面交联键的数目。分子间

42、交联分子间交联 用双功能或多功能试剂使不同的酶用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂合酶。交联起来产生杂合酶。二、内部二、内部修饰修饰1.酶蛋白主链修饰酶蛋白主链修饰2.催化基团的修饰催化基团的修饰3.肽链伸展后的修饰肽链伸展后的修饰1、酶蛋白主链修饰、酶蛋白主链修饰 酶法：酶原酶法：酶原酶酶 酶蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）酶蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）利用酶分子利用酶分子主链的切断和连接主链的切断和连接，使酶分子，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。改变酶的特性和功能的方法。蛋白主链修饰采用酶法（蛋白

43、主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白酶用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂或肽酶为修饰剂）。）。酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：下三种情况中的一种：1、引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能、引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2、仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3、有利于活性中心与底物结合并形成准确的、有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。催化部位，酶活力提高。后两种情况，后两种情况，肽链的水解在限定的肽肽链的水解在限定的肽键上进行键上进行，称，称肽链有限水解肽链有限水解。2、催化

44、基团的修饰、催化基团的修饰 定点突变：转变氨基酸侧链定点突变：转变氨基酸侧链 氨基酸的置换修饰可以采用化学修饰方法氨基酸的置换修饰可以采用化学修饰方法。例如，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的草杆菌蛋白酶活性中心的Ser转换为转换为Cys，修，修饰后该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，饰后该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性，因此可用于肽的合成。因此可用于肽的合成。缺点缺点：化学修饰法：化学修饰法 难度大，成本高，专一难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修

45、饰，操性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业作复杂，难以工业 化生产。化生产。3、肽链伸展后的修饰、肽链伸展后的修饰 先用变性剂对酶进行变性处理，再进行修饰，先用变性剂对酶进行变性处理，再进行修饰，然后重新折叠成某种活性的构象。然后重新折叠成某种活性的构象。Saraswothi等，先让酶变性，然后加入竞争性等，先让酶变性，然后加入竞争性抑制剂，待获得所希望酶的构象后，用戊二醛固定抑制剂，待获得所希望酶的构象后，用戊二醛固定，然后透析除去抑制剂。，然后透析除去抑制剂。他们以丙酸作竞争性抑制他们以丙酸作竞争性抑制剂，把核糖核酸酶制成一种剂，把核糖核酸酶制成一种“酸性脂酶酸性脂酶”，从

46、而改，从而改变了酶的底物专一性、创造了新的酶活力。变了酶的底物专一性、创造了新的酶活力。三、与辅因子相关的修饰三、与辅因子相关的修饰 1、对依赖辅因子的酶的修饰、对依赖辅因子的酶的修饰 1）、如果辅因子与酶是非共价结合，则可将辅因子共价）、如果辅因子与酶是非共价结合，则可将辅因子共价结合到酶分子上。结合到酶分子上。2）、引入新的具有强反应的辅因子。迄今最成功的例子）、引入新的具有强反应的辅因子。迄今最成功的例子是是Kaiser将黄素共价结合在木瓜蛋白酶上，利用黄素将黄素共价结合在木瓜蛋白酶上，利用黄素的溴酰衍生物与木瓜蛋白酶的共价结合成为黄素木瓜的溴酰衍生物与木瓜蛋白酶的共价结合成为黄素木瓜蛋

47、白酶，从而将蛋白酶转变成氧化还原酶。蛋白酶，从而将蛋白酶转变成氧化还原酶。3、金属离子置换金属离子置换修饰修饰Metal ion substitute modification2、金属酶的金属取代、金属酶的金属取代 可改变酶的专一性、稳定性、抑制作用等。可改变酶的专一性、稳定性、抑制作用等。把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐明通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐明催化机制催化机制

48、适用对象：适用对象：（metalloenzyme）一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子作为一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子作为 金属离子或是直接参与催化作用，或是对保持酶的活性和构金属离子或是直接参与催化作用，或是对保持酶的活性和构象起稳定作用象起稳定作用 金属酶纯化时仍保留着金属酶纯化时仍保留着的功能金属离子的功能金属离子 常见的金属酶及其离子种类常见的金属酶及其离子种类-淀粉酶淀粉酶 Ca2+、Mg2+、Zn2+谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 Zn2+过氧化氢酶过氧化氢酶 Fe2+酰基氨基酸酶酰基氨基酸酶 Zn2+超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 Cu2+、Zn2+细胞色素细胞色素 P450

49、 单加氧酶单加氧酶 Fe2+固氮酶固氮酶 Fe(II)、Mo(IV)谷胱甘肽过氧化物酶谷胱甘肽过氧化物酶 Se(IV)主要的金属离子主要的金属离子 Ca、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn 等等Cyt P450 金属离子置换修饰的方法金属离子置换修饰的方法 酶的提纯酶的提纯 除去原有金属离子除去原有金属离子 加入加入金属螯合剂金属螯合剂，如，如 EDTA 等，让酶分子中的金属等，让酶分子中的金属离子与离子与 EDTA形成螯合物形成螯合物 透析、超滤或层析除去螯合物透析、超滤或层析除去螯合物 加入置换的离子加入置换的离子 加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋白与其结合加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋

50、白与其结合 用透析或层析等方法除去未结合的离子用透析或层析等方法除去未结合的离子 金属离子置换修饰的作用金属离子置换修饰的作用 阐明金属离子对酶催化作用的影响阐明金属离子对酶催化作用的影响 一般在活性中心的金属离子能与底物或辅酶一般在活性中心的金属离子能与底物或辅酶/辅基可逆结合辅基可逆结合，从而起到催化作用，从而起到催化作用 提高酶的催化效率提高酶的催化效率 将将 Zn 型型-淀粉酶置换成淀粉酶置换成 Ca 型，活力可提高型，活力可提高 20%30%增强酶的稳定性增强酶的稳定性 Fe-SOD 置换成置换成 Mn-SOD 后稳定性增强，对后稳定性增强，对 NaN3 敏感性降敏感性降低低 改变酶