PCR测定中常见问题分析课件.pptx

1、PCR测定中常见问题分析PPT课件结果不准确 试剂耗材的质检试剂耗材的质检 标本的采集与储存标本的采集与储存 仪器设备清洁维护（仪器设备状态）仪器设备清洁维护（仪器设备状态）人员操作人员操作-试剂准备试剂准备 人员操作人员操作-样本的制备样本的制备-核酸纯化核酸纯化 人员操作人员操作-加样加样 设备状态设备状态-扩增、检测扩增、检测 结果分析结果分析 报告解释报告解释污染控制第2页/共30页标本的采集与储存1.采集的容器 例如：血液样本，采血管规格，抗凝剂种类？容器到达实验室时应处于未曾开启状态2样本的保存 检测前、检测后 保存容器？纯化后DNA的保存 避免反复冻融 第3页/共30页仪器设备状

2、态1.仪器设备校准加样器 方式：计量部门、厂家、自校准扩增仪 方式：厂家温浴设备、温湿度计2.设备状态清洁维护 第4页/共30页试剂的配制保证反应的均一性，每次试验的扩增反应混和液应一次配出，并至少多配1人份。配制时注意：试剂充分复融、混匀，开盖前瞬时离心；配制后充分混匀，但不可剧烈震荡，分装前瞬时离心。配制后不宜放置过久，因为PCR/RT-PCR反应液中的酶、引物、底物在低温与室温下均可按较低的效率起反应而消耗部分原料产生非特异的引物二聚体等，造成扩增效率降低，一般的建议是配制完PCR反应液后的0.53小时内应及时上机扩增，加模板后应尽快上机第5页/共30页试剂准备、加样1.试剂配制的均一性

3、、分装的均一性2.常用试剂的分装、储存及使用容器3.加样准确性和重复性 加样量加样量第6页/共30页样本的制备-核酸纯化1.核酸提取方法2.人员操作3.仪器设备状态4.样本量 第7页/共30页样本的制备-核酸纯化n一般原理：均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。n一般步骤：去垢剂裂解-蛋白酶处理-有机溶剂提取-乙醇沉淀等步骤。n纯化目的：核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。1.核酸提取方法第8页/共30页样本的制备-核酸纯化 纯化质量评价：抑制物的去除抑制物的去除 来自样本来自样

4、本-血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份、降解靶核酸的核酸酶等。来自提取过程来自提取过程-乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂。保证措施：保证措施：对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施；核酸提取及扩增有效性的质控第9页/共30页样本的制备-核酸纯化2.人员操作人员操作 加样的准确 避免交叉污染 振荡的幅度、时间 温育的温度、时间 第10页/共30页样本的制备-核酸纯化3.仪器设备状态 离心机 金属浴/水浴 加样器 全自动样本处理系统第11页/共30页样本的制备-核酸纯化1纯化的原则 防

5、止和抑制DNase对DNA的降解；尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏，保持DNA分子的完整；将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。2可能出现的问题 模板中含有杂蛋白质，特别是染色体中的组蛋白 模板中含有Taq酶抑制剂；在提取制备模板时丢失过多，提取效率低 提出过程中引入的有机溶剂未去除。第12页/共30页样本的制备-核酸纯化4.样本量50l 样本 灵敏度500IU/ml 200l 样本 灵敏度50IU/ml第13页/共30页扩增、检测1加模板（上样）加入提取好的核酸模板时需格外小心，往往PCR扩增所需加入的模板量只有2l，加样器的使用显得尤其重要，须控制加样精密度于准确的。扩增管盖子要盖紧，扩

6、增管盖子要盖紧，管盖没有盖好造成PCR反应液热蒸发，影响反应温度的准确控制及反应也各成份的浓度，同时也成为一个污染源。（压盖时由于粗心或者用力不均致使部分盖子变形，也是实验室常见的问题）第14页/共30页扩增、检测熟悉仪器设备的特点，标本的放置，参数设置扩增、检测 影响因素：引物、探针、仪器设备状态 扩增效率：第15页/共30页关于污染1样本的污染 微生物、操作人员、标本之间的交叉污染2扩增产物或模板的污染 试剂、加样器、操作台面 PCR产物拷贝量大产物拷贝量大(一般为一般为1013拷贝拷贝/ml)，所以极微量的PCR产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性。气溶胶气溶胶：空气与液体面摩擦时就可

7、形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染，据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝。第16页/共30页关于污染1样本的污染 微生物、操作人员、标本之间的交叉污染2扩增产物或模板的污染 试剂、加样器、操作台面 PCR产物拷贝量大产物拷贝量大(一般为一般为1013拷贝拷贝/ml)，所以极微量的PCR产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性。气溶胶气溶胶：空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染，据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝。第17页/共30页关于污染 3.

8、污染的监测-阴性对照 每次PCR实验务必做阴性对照，它包括：阴性标本对照 空白试剂对照第18页/共30页关于污染4防止污染的方法 实验室合理分区 制定工作流程并严格执行 实验室的清洁使用哪种消毒（去污染）剂？设备、加样器、工作台面.选择盐酸还是次氯酸？去污染效果取决于有效氯的浓度：去污染效果取决于有效氯的浓度：0.05 0.5%第19页/共30页关于污染5何时、怎样去污染？喷洒10%bleach 15-30min 清水擦 每次PCR后和泄漏时进行第20页/共30页第21页/共30页第22页/共30页关于污染 含氯消毒液的稀释和贮存：用洁净的水稀释消毒液，自来水虽然方便，但是次氯酸不稳定，尤其是

9、在水质较硬的情况下；尽量新鲜配置，1：10稀释的消毒液，1-2周稳定；稀释的含氯消毒液放在室温不透明的容器里；将稀释的次氯酸消毒液放在常规使用的喷雾瓶中，放在水槽下。温度、光照和氧化作用都可以使之分解变质。第23页/共30页关于污染紫外紫外灯的使用灯的使用 紫外波长（紫外波长（nm）一般选择）一般选择254/300nm 照射照射30min 即可 有效距离有效距离：60-90cm需要注意的是，选择UV 作为消除残留PCR 产物污染时，要考虑PCR 产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV 照射仅对照射仅对500bp 以上长片段有效，对短片段效果不大。以上长片段有效，对短片段效果不大。第24页/共3

10、0页其他细节问题加样器加样器 吸样器污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。第25页/共30页其他细节问题预混和分装预混和分装PCR试剂试剂 PCR试剂都应小量分装，避免污染机会。PCR反应液应与阳性对照、样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。第26页/共30页其他细节问题选择质量好的选择质量好的Eppendorf管管 以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。第27页/共30页其他细节问题标本的长期保存标本的长期保存尽量用带乳胶垫环的罗口管，保证密闭。第28页/共30页第29页/共30页谢谢您的观看！谢谢您的观看！第30页/共30页