高中生物核心概念高考复习课件-微生物培养与应用B.ppt

1、主要内容：主要内容：大肠杆菌的纯化培养大肠杆菌的纯化培养分解尿素的细菌的计数分解尿素的细菌的计数分解纤维素微生物的分离分解纤维素微生物的分离技术技术方法方法利用利用考纲要求：微生物的培养和利用考纲要求：微生物的培养和利用1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方大肠杆菌的纯化培养大肠杆菌的纯化培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨

2、易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解 取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂琼脂 补水定容补水定容4.4.调调pHpH、分装、封口：分装、封口：5.5.灭菌：灭菌：6.6.倒平板：倒平板：培养基、培养皿培养基、培养皿分散成单个细胞分散成单个细胞,形成单个菌落形成单个菌落约约50防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基防止瓶口的微生物污染培养基大肠杆菌的纯化培养大肠杆菌的纯化培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：平板划线法

3、：平板划线法：菌种菌种划划3 3个个平板平板1 1个个不划线不划线1.1.接种：接种：接种环接种环防止划破培养基防止划破培养基（重复实验）（重复实验）（空白对照）（空白对照）平板划线法平板划线法 为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？接种环吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物上可能存在的微生物污染培养物 杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，杀死上次残留的菌种，保证使下一

4、次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。便得到菌落。及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。染环境和感染操作者。6 6支支试管，分别加入试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀释涂布平板法稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液梯度稀释菌液：菌液菌液微量微量 移移液器液器稀释涂布平板法稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释

5、菌液梯度稀释菌液：b.b.涂布平板涂布平板：不超过不超过0.1ml0.1ml各各梯度分别涂布梯度分别涂布3个平板个平板1 1个个不涂布作空白对照不涂布作空白对照滴滴灼灼试试涂涂稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍平板划线法：平板划线法：大肠杆菌的纯化培养大肠杆菌的纯化培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：1.1.接种：接种：稀释涂布平板法稀释涂布平板法：2.2.培养：培养：将将接种后接种后的培养基和一个的培养基和一个未接种未接种的培养基的培养基放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24

6、h后，后，观察并记录观察并记录菌种的保藏：菌种的保藏：1.1.临时保藏：临时保藏：试管固体斜面培养基上试管固体斜面培养基上442.2.长期保存：长期保存：菌种易被污染、变异菌种易被污染、变异甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油甘油1ml1ml菌液菌液2020尿素尿素CO(NHCO(NH2 2)2 2重要的农业氮肥。重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为只能被土壤中细菌分解为NHNH3 3才能被植物吸才能被植物吸收利用收利用 CO(NH CO(NH2 2)2 2+H+H2 2O COO CO2 2+2NH+2NH3 3细菌脲酶细菌脲酶u筛选菌株筛选菌株 提出的问题提出的问题 如何寻找如何寻找耐高温耐

7、高温的酶？的酶？解决问题的思路解决问题的思路 寻找寻找耐高温耐高温环境；环境；原理原理 高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。耐高温菌种提取耐高温酶。u筛选菌株筛选菌株KHKH2 2POPO4 4 1.4g 1.4g NaHPO NaHPO4 4 2.1g 2.1g MgSO MgSO4 4 H H2 2O 0.2gO 0.2g 葡萄糖葡萄糖 10.0g10.0g 尿素尿素 1.0g1.0g 琼脂琼脂 15.0g15.0g 将上述物质溶解后将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到，用蒸馏水定容到1000mL1000mL。该培养基的配方中，为该培养基的配

8、方中，为微生物的生长提供碳源和氮微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？源的分别是什么物质？此配方能否筛选出产生此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？脲酶的细菌？为什么？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素氮源：尿素能。只有产生脲酶的能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮细菌能利用尿素作为氮源而生存。源而生存。u筛选菌株筛选菌株1 1、选择培养基：、选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。养基。2 2、菌株：、菌株：纯且活状态所保存的菌种纯且活状态所保存的菌种。u统计菌落数目：

9、统计菌落数目：1 1、活体计数法（、活体计数法（稀释涂布平板稀释涂布平板）（1 1）操作方法：）操作方法：稀释涂布平板稀释涂布平板统计菌落数统计菌落数 （2 2）原理：）原理：1 1个菌落个菌落1 1个活菌个活菌 （3 3）统计原则）统计原则 选选 3030 300 300 个菌落的平板统计个菌落的平板统计 每个稀释度取每个稀释度取3 3个平板取个平板取其其平均值平均值为什么？例：两位同学用稀释涂布平板法测定同例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，得到以下两种统计结果。的培养基中，得到以下两种统

10、计结果。1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为菌落数为230230。2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂布了A A、B B、C C三个平板，三个平板，统计的菌落数分别为统计的菌落数分别为2121、212212、256256，该同学以这三个，该同学以这三个平板上菌落数的平均值平板上菌落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？错在哪？甲：没有甲：没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板）个平板）乙：乙：A A组结果误

11、差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值u统计菌落数目统计菌落数目 1 1、活菌计数法、活菌计数法 （4 4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目实际数目低低，因此统计结果一般用菌落数表，因此统计结果一般用菌落数表示。示。每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=（C/V)C/V)*M M C C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V V:所用稀释液的体积；所用稀释液的体积；M:M:稀释倍数。稀释倍数。为什么？2、显微观察法：比例计数或直接计数（血球计数板）、显微观察法：比例计数或直接计数（血球计数

12、板）计数室（中央大方格）的长、宽和高分别为：计数室（中央大方格）的长、宽和高分别为：1 mm、1 mm和和 0.1mm 计数室的容积：计数室的容积：0.1mm3（万分之一毫升）（万分之一毫升）取样：稀释一定倍数的菌液取样：稀释一定倍数的菌液酵母细胞数酵母细胞数/ml80小格内酵母细胞个数小格内酵母细胞个数/80400104稀释倍数稀释倍数 计数顺序：计数顺序：左上左上右上右上右下右下左下左下 压在格线的，只统计左线和上线压在格线的，只统计左线和上线3.称重法：称重法：一个细胞（细菌）一般重约一个细胞（细菌）一般重约10121013g4.4.比浊法记数比浊法记数 当细菌浓度达到当细菌浓度达到10

13、7个个/ml时时,培养基会浑浊培养基会浑浊 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为过程中，从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，的培养基中，A A、B B两同学分别得到以下两种统计结果。两同学分别得到以下两种统计结果。1 1、A A同学筛选出同学筛选出150150个菌落。个菌落。2 2、B B同学筛选出同学筛选出5050个菌落。个菌落。B B认为认为A A的培养基被杂菌污染了，或培养基的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。素的细菌也能在

14、该培养基中生长。A A确认自己确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。请你帮助请你帮助A A同学改进实验，提供具有说明同学改进实验，提供具有说明了的证据。了的证据。设置对照设置对照同等条件下，培养空白培养基同等条件下，培养空白培养基u设置对照设置对照 1 1、设置对照的目的：、设置对照的目的：排除实验组中非测试因素对实验结排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验对照实验是指除了是指除了 被测试被测试 的条件外的条件外，其他条件都，其他条件都 相同相同 的实验。满足该条的实验。满足该条件

15、的称为件的称为 对照对照组，未满足该条件的称组，未满足该条件的称为为 实验实验 组。组。尿素培养基尿素培养基未接种的尿未接种的尿素培养基素培养基10-510-4实验过程实验过程 （一）土壤取样（一）土壤取样 1 1、取样的位置：、取样的位置：土壤，天然培养基，含有大量的微生物，土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中其中7070 9090是细菌。在富含有机质的土壤层是细菌。在富含有机质的土壤层的的3 3 8cm8cm处中分布着绝大多数的细菌。处中分布着绝大多数的细菌。2 2、取样要求：铲去表层土。、取样要求：铲去表层土。菌落计数菌落计数配制土壤溶液配制土壤溶液系列稀释系列稀释涂布平板与培养涂布

16、平板与培养（二）样品稀释（二）样品稀释 （1 1）测细菌数：一般用）测细菌数：一般用10104 4、10105 5、10106 6稀释液稀释液 （2 2）测放线菌：一般用）测放线菌：一般用10103 3、10104 4、10105 5稀释液稀释液 （3 3）测真菌数：一般用）测真菌数：一般用10102 2、10103 3、10104 4稀释液稀释液原则：确保平板上的菌落数在原则：确保平板上的菌落数在3030 300300之间。之间。（三）微生物的培养与观察（三）微生物的培养与观察 1 1、接种：用适当的稀释液作涂布平板、接种：用适当的稀释液作涂布平板 2 2、培养：细菌：、培养：细菌：3030

17、 3737，1 1 2d;2d;放线菌放线菌:25:25 28,528,5 7d;7d;霉菌霉菌:25:25 28,328,3 4d.4d.3 3、观察：、观察：a.a.每每24h24h统计一次菌落数目统计一次菌落数目 b.b.以以“稳定稳定菌落菌落”为观察对象为观察对象 （四）鉴定（四）鉴定鉴别培养基：不影响鉴别培养基：不影响微生物的生存微生物的生存酚红培养基：酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌鉴定分解尿素的细菌原理：脲酶催化尿素原理：脲酶催化尿素分解成氨分解成氨培养基碱培养基碱性增强性增强 酚红变红酚红变红脲酶阳性脲酶阳性 纤维素酶是一种纤维素酶是一种复合酶复合酶，一般，一般认为它至少包括三种

18、组分认为它至少包括三种组分，即，即C1酶、酶、CX酶和葡萄糖苷酶酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤酶将纤维二糖分解成葡萄糖。维二糖分解成葡萄糖。纤维素纤维素纤维纤维二糖二糖葡萄糖葡萄糖C1酶酶Cx酶酶葡萄糖葡萄糖苷酶苷酶背景知识背景知识滤滤纸纸崩崩溃溃法法纤维素酶活性的测定实验：纤维素酶活性的测定实验：背景知识背景知识 刚果红可以与纤维刚果红可以与纤维素形成素形成红色复合物红色复合物，当，当纤维素被纤维素被纤维素酶纤维素酶分解分解后，红色复合物无法形后，红色复合物无法形成，出现以成，出现以纤维素分解纤维素分解菌菌为中心的为中心的

19、透明圈透明圈，我，我们可以通过们可以通过是否产生透是否产生透明圈明圈来筛选纤维素分解来筛选纤维素分解菌。菌。背景知识背景知识实验流程示意图实验流程示意图实验设计实验设计实验设计实验设计实验设计实验设计实验设计实验设计实验设计实验设计实验设计实验设计酵母膏：实际上是膏状的酵母抽提物，酵母抽提物是国家行业标准的规定名称。酵母抽提物以酵母为原料，采用自溶法或加酶水解法工艺，经分离、脱色而成的，含氨基酸、肽、多肽及酵母细胞水溶性成分的产品。实验设计实验设计思考：思考：1 1.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？解菌？2 2.将滤纸埋在土壤中有什么作用？

20、你认为滤纸应将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？该埋进土壤多深？将将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一适宜环境。一般将纸般将纸埋于深约埋于深约10cm10cm左右腐殖土左右腐殖土壤中。壤中。实验设计实验设计“浓缩浓缩”作用作用u将土样加入装有将土样加入装有30ml30ml选择培养基的锥形瓶选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养下振荡培养1-2d1-2d，直至培养液变混浊。，直至培养液变混浊

21、。u吸取一定量的培养液，转移至另一瓶新鲜吸取一定量的培养液，转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变混浊。养液变混浊。根据样品中目的菌株数量来确定是否需要根据样品中目的菌株数量来确定是否需要。实验设计实验设计实验设计实验设计鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基 挑选产生透明圈的菌落。挑取产生明显的挑选产生透明圈的菌落。挑取产生明显的透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在30300 0C C37370 0C C培养，可

22、获得纯培养。培养，可获得纯培养。实验设计实验设计刚果红染色法刚果红染色法方法一：方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。颜色反应。方法二：方法二：在倒平板时就加入刚果红。在倒平板时就加入刚果红。实验设计实验设计微生物培养的基本程序微生物培养的基本程序培养基的配制培养基的配制称量称量溶化溶化调调pH分装分装包扎包扎灭菌灭菌（高压蒸汽灭菌）（高压蒸汽灭菌）接种接种固体培养基固体培养基平板划线（接种环）、稀释涂布（玻璃刮刀）平板划线（接种环）、稀释涂布（玻璃刮刀）液体培养基液体培养基用接种环蘸取菌液（扩大培养）用接种环蘸取菌液（扩大培养）培养培养 固体培养基固体培养基倒置，倒置，37恒温培养箱，恒温培养箱，24h左右左右液体培养基液体培养基空气浴或水浴培养箱（摇床），震荡培养空气浴或水浴培养箱（摇床），震荡培养固体培养基固体培养基划线的末端出现单菌落划线的末端出现单菌落液体培养基液体培养基培养液变浑浊培养液变浑浊观察观察 废弃菌种和培养基灭菌后丢弃废弃菌种和培养基灭菌后丢弃