青蒿素分析方法的确定2021优秀课件.ppt
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1、青蒿素分析方法的确定青蒿 青篙为菊科一年生草本植物黄黄花篙花篙干燥地上部分,性寒,味苦、辛,归肝胆经,可清热解暑、除蒸、截疟,主要分布于重庆、四川、云南、广西等地。目前青篙目前青篙素系列药物已取代奎宁成为治疗素系列药物已取代奎宁成为治疗疟疾的最安全有效的药物疟疾的最安全有效的药物。青蒿素是青蒿抗疟的有效成分,也是合成青蒿素系列药物的起始原料,它的需求量很大。为什么要测定青蒿素的含量 不同产地的青蒿药材中青篙素的含量差异较大,而青蒿素是青篙截疟的主要有效成分,因此对药材中青篙素含量的准确测定十分必要。提取青蒿素的溶剂提取青蒿素的溶剂:青蒿素C15H22O5 在丙酮丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷或苯中易
2、溶,在甲醇、乙醇、稀乙醇、乙醚及石油醚石油醚中溶解,在水中几乎不溶解;在冰醋酸中易溶。青蒿素的有效成分 青蒿素青蒿素是从黄花蒿中提取分离得到的含过氧基团的含过氧基团的新型半萜内酯新型半萜内酯。其多种衍生物均是治疗疟疾的有效单体,国内外公认的首创首创新药新药。将青蒿素结构中的C-10为羰基还原成羟基得双氢青蒿素,进一步烷基氧化得蒿甲醚,而进行酯化可得到青蒿琥酯。青蒿素青蒿素 artemisinin双氢青蒿素双氢青蒿素为天然抗疟药青篙素经钠硼氢还原而产生的半缩醛化合物,其12 位的羟基具有差向异构,差向异构体a 与 在一定溶剂中有相互转化并达到平衡的过程。DHA 分子结构中无共扼结构和发色基团,不
3、宜用分光光度法或HPLC法测定含量。双氢青蒿素双氢青蒿素dihydroartemisinin双氢青蒿素定性分析定性分析定量分析定量分析紫外分光光度法紫外分光光度法IR、MS、NMRHPLC(UV、ELSD、SPD.)UPLCLC-MS/LC-MS-MS高效毛细管电泳高效毛细管电泳CETLC1.1 青蒿素的IR定性分析双氢青蒿素双氢青蒿素dihydroartemisinin3376 O-H;1227 C-O;1025 C-O-C;2925 -CH3;总结:总结:IR专属性强,一般做标准谱图对照法专属性强,一般做标准谱图对照法1.2紫外分光光度法原理原理:1.由于青蒿素药物分子结构中母核不具有共轭
4、体系,其紫外吸收光谱的主要是末端吸收。但C-10位由于取代基不同具有一定的吸收特征。2.青蒿素由于具有过氧桥和缩醛结构过氧桥和缩醛结构,对酸碱不稳定,对强碱极不稳定,热至熔点以上即迅速分解。采用0.2%氢氧化钠50水浴加热30min 进行水解,水解后的波长扫描结果显示青蒿素在紫外区有最大吸收峰Kmax=290.5nm,由此确定最适波长为292nm。(青蒿素衍生化,酸化后亦可作青蒿素衍生化,酸化后亦可作HPLC-UV检测检测)1.青蒿素标准品青蒿素标准品0.1g+95%稀释成稀释成0.001%的标准品溶液的标准品溶液2.0.001%标准溶液标准溶液0.5 ml加入加入95%乙醇乙醇4.5ml,再
5、加入再加入0.2%NaOH 20ml定容至定容至25ml,50水浴加热水浴加热30min,取取出快速冷却。出快速冷却。3.分别取分别取0.5、1.0、2.0ml 的的.001%青蒿素标准溶液青蒿素标准溶液,分别加入分别加入95%乙乙醇醇4.5、4.0、3.0ml,再各加入再各加入0.2%NaOH 20ml定容至定容至25ml,配成浓配成浓度分别为度分别为210-5%、410-5%、810-5%的标准溶液的标准溶液,50水浴水浴加热加热30min,取出快速冷却取出快速冷却,在已经确立的最适波长下分别测吸光度。在已经确立的最适波长下分别测吸光度。4.样液的制备样液的制备取青蒿待测样品研细粉末取青蒿
6、待测样品研细粉末0.5g,加入加入95%乙醇乙醇10ml 浸泡浸泡,50水浴加水浴加热热60min 进行提取进行提取,取出样品振摇、冷却、过滤取出样品振摇、冷却、过滤,取滤液取滤液1ml,加入加入95%乙醇乙醇14ml,再加入再加入0.2%NaOH 10ml,配制成青蒿素样品溶配制成青蒿素样品溶液液,50水浴加热水浴加热30min。在已经确立的最适波长下分别测吸光度。在已经确立的最适波长下分别测吸光度,对对浓度作图浓度作图,建立标准曲线。建立标准曲线。青蒿素含量青蒿素含量=(青蒿素样品浓度标准浓度单位原始青蒿素样品浓度标准浓度单位原始体积体积)/青蒿研细粉末质量青蒿研细粉末质量朗伯比尔定律:朗
7、伯比尔定律:A=-lgT=bcb,一定,吸光度A和溶液浓度c成正比UV法总结UV法测定青蒿素是依据青蒿素在碱性条件下生成的青蒿素衍生物 Q292在292 nm波长处有较强的紫外吸收来定量的,其优点是操作简单,对仪器设备的要求不高,其缺点是不能排除青蒿素类似物排除青蒿素类似物等物质的干扰。因此,UV法测定青蒿中青蒿素的含量实际反映的是药材中青蒿素及其类实际反映的是药材中青蒿素及其类似物的总量似物的总量。陈靖等5报道,青蒿中青蒿素类似物青蒿酸、青蒿酸、青蒿素青蒿素B、3-羟基羟基-1-去氧青蒿素去氧青蒿素的平均含量分别为0.47、0.05、0.005,对青蒿中青蒿素含量的测定影响较大,使得测定结果
8、偏高。1.3 HPLC法常见检测器常见检测器:1.UV2.DAD(二极管阵列检测器)3.FD(荧光检测器)4.RID(示差折光率检测器)5.ECD(电化学检测器)6.ELSD(蒸发光散射器检测器)原理:利用流动相与组分间的亲和力亲和力,通过组分、流动相和固定相三者间的相互作用来实现分离。文献报道同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的方法有HPLC-UV-ECD法(高效液高效液相色谱紫外电化学检测法相色谱紫外电化学检测法)、HPLC-MS/MS法,采用ELSD法(蒸发光散射检测蒸发光散射检测法法)检测仅有很弱紫外吸收的青蒿素、UV法检测青蒿中含量较低的青蒿乙素和青蒿酸。蒸发光散射检测器蒸发光散
9、射检测器(ELSD)为通用型的质量检测器,对结构相似物质可给出几乎相同的响应因子,响应值大小取决于物质浓度及检测条件下物质颗粒的取决于物质浓度及检测条件下物质颗粒的大小大小,而不依赖于紫外吸收,因此适合于青蒿素及青蒿素及双氢青蒿素双氢青蒿素的含量测定。1.3.1 HPLC-ELSD法SPD(二极管阵列检测器二极管阵列检测器)与ELSD 同时检测,发现双氢青蒿素转化平衡后SPD图中。a异构体与异构体峰面积之比为4:1,而ELSD 检测得。a异构体与异构体峰面积之比为8:1。因为E L SD 对结构相似物质能给出几乎一致的响应因子,属于质量响应型检测器,因此得到的峰面积比峰面积比即为转化平衡后a异
10、构体与异构体的实际物质量比实际物质量比。从而也可得知a与异构体对U V 的响应因子不同,如用UV 检测则不能直接采用二者峰面积之和定量。例:例:HPLC-ELSD 法测定复方双氢青篙素片中双法测定复方双氢青篙素片中双氢青篙素的含量氢青篙素的含量2.对照品溶液对照品溶液:取复取复方双氢青篙素片10 片,剥去薄膜衣,精密称定,研细,精密称取适量,置25 m L量瓶中,加乙睛适量,40 超声处理5 min。放冷至室温,定容。摇匀,滤过,取续滤液2 mL 加水稀释至10 mL。例:复方双氢青篙素片(含双氢青篙素32 m g,磷酸呱哇0.32g,甲氧苄啶90 m g)中青蒿素含量的测定1.对照品溶液对照
11、品溶液:精密称取D H A 对照品适量,置50 m L 量瓶中,加乙睛适量,40 超声处理5 min。放冷至室温,定容,即得1.28 m g/m L的对照品储备液。再精密量取此储备液适量,用水稀释制成256 mg/m L的对照品溶液。ELSD检测器检测时少量溶解的甲氧苄啶峰及检测器检测时少量溶解的甲氧苄啶峰及a异构体峰与异构体峰与异构体峰异构体峰均能达到完全分离均能达到完全分离,三者的分离度分别为三者的分离度分别为2、8 和和4,a异构体与异构体与异构异构体保留时间分别约为体保留时间分别约为5.7 m in和和7 m in,理论板数按理论板数按a异构体或异构体或异异构体峰计均不低于构体峰计均不
12、低于6000。SPD扫描图谱显示最先流出的成分为甲氧扫描图谱显示最先流出的成分为甲氧苄啶苄啶,与后面的与后面的a异构体及异构体及异构体完全分离异构体完全分离,不影响测定。不影响测定。1.3.2 HPLC-UV-ELSD同时测定青蒿青蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的方法青蒿素只有很弱的末端紫外吸收,一般不用UV法进行精确定量分析,故选择用ELSD法检测。用ELSD法也可检测青蒿乙素和青蒿酸,但由于其灵敏度低,对这两个成分含量低的青蒿药材来说,该法同时测定3种成分较困难,故采用灵敏度较高的UV法对青蒿乙素和青蒿酸进行定量测定。UV检测器对所测成分性质无任何影响,据此可使用HP
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