实验八-质粒DNA的转化及鉴定.ppt

1、质粒DNA的转化 及鉴定,原理,感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。,转化（transformation）：,是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。,转化

2、的方法：,化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。,克隆的筛选：,主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；,将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。,重组质粒克隆的鉴定,鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切

3、分析，对于带有LacZ基因的载体还可以结合-互补现象来筛选。,载体质粒和转化受体菌株,pBR322质粒： LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息 Top10菌株：带有-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息,初步筛选：抗药性标志选择,载体质粒DNA pBR322上带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有质粒DNA pBR322的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选 。,-互补现象：,载体质粒DNA（pBR322）带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码-互补肽，该肽段能

4、与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（ -互补）。当这种载体转入可编码半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞（Top10菌株）中时，在异丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为-互补现象。,蓝-白筛选 利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。,载体：编码-半乳糖 宿主： 编码-半乳糖 苷酶N端序列 苷酶C端序列,-互补,细菌表达： -半乳糖苷酶活性,5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） 形成蓝色菌落,当在质粒中插入外源DNA-半乳糖苷酶的N端基因失活 不能与宿主-

5、半乳糖苷酶的C端进行-互补产生白色菌落。,（IPTG 存在下）,蓝白筛选示意图,试剂与器材,试剂 LB培养基；0.1mol/LGaCl2；甘油；LB抗生素平板（均为灭菌的） 器材 恒温培养箱,实验步骤,细菌感受态的制备： Top10菌株培养过夜，以1:100比例接种培养3小时，冰浴30min，分装于EP管，2500rpm 4离心4min。 弃上清，沉淀重悬于1ml预冷0.1mol/L CaCl2 ，冰浴15min，2500rpm 4 离心4min。 弃上清，沉淀轻悬于0.2ml预冷0.1mol/L CaCl2 (此时细菌易破碎)，置冰浴。,转化： 加入质粒DNA 20l，冰浴30min。 42热冲击2min ，迅速冰浴2min。 加1ml Amp LB培养基，37振荡培养1小时（250rpm/min）。 取Amp+LB平板，用40l -gal(20mg/ml)、4l IPTG(200mg/ml)均匀涂于平板上。 取20-50l培养产物涂Amp+平板。 倒置平板，37培养过夜，观察蓝白菌斑。,Blue White Screening,