分子生物学:基因突变2-研究生课件知识讲解.ppt
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- 分子生物学 基因突变 研究生 课件 知识 讲解
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1、Chapter 11 Gene MutationSection 1 Basic Concept of Gene Mutationn任何因素引起基因组任何因素引起基因组DNA分子一级结构的异常分子一级结构的异常改变,并导致生物个体表型的改变,称为改变,并导致生物个体表型的改变,称为基因基因突变(突变(gene mutation)。n根据引起基因突变的原因,可将其分为根据引起基因突变的原因,可将其分为自发突自发突变(变(spontaneous mutation)和和诱发突变诱发突变(induced mutation)。n根据发生基因突变的细胞的不同,可将其分为根据发生基因突变的细胞的不同,可将其分
2、为生殖细胞突变(生殖细胞突变(germ cell mutation)和和体细体细胞突变(胞突变(somatic mutation)。Section 2 Classification and Characteristics of Gene Mutation1.Type of Gene Mutationn主要根据主要根据DNA一级结构改变情况分类。一级结构改变情况分类。可分为可分为单点突变单点突变(single point mutation)和和多点突变多点突变(multiple point mutation)。)。点突变的形式包括点突变的形式包括转换转换(transition)、)、颠颠换换(t
3、ransversion)、)、插入插入(insertion)、)、缺失缺失(deletion)等。)等。1.1 Point Mutationn基因组基因组DNA中插入了其他的中插入了其他的DNA小片段,导致小片段,导致读码框改变或基因失活。读码框改变或基因失活。1.2 Insertion Mutation of DNA Fragmentn基因组基因组DNA中丢失了小片段中丢失了小片段DNA,导致读码框,导致读码框改变或基因失活。改变或基因失活。1.3 Deletion Mutation of DNA FragmentnDNA碱基改变后,形成相应的简并密码,其编碱基改变后,形成相应的简并密码,其
4、编码的多肽链氨基酸序列不发生改变,称为码的多肽链氨基酸序列不发生改变,称为同义同义突变突变。2.Results of Gene Mutation2.1 Synonymous MutationnDNA碱基序列改变导致其编码的多肽链氨基酸碱基序列改变导致其编码的多肽链氨基酸序列改变,称为序列改变,称为错义突变错义突变。n错义突变后的编码产物仍然保留部分生物学活性,错义突变后的编码产物仍然保留部分生物学活性,则称为则称为渗漏突变渗漏突变(leaky mutation)。)。n错义突变后的编码产物如能全部保留原有生物学错义突变后的编码产物如能全部保留原有生物学活性,则称为活性,则称为中性突变中性突变(
5、neutral mutation)。)。2.2 Missence MutationnDNA碱基序列改变而产生终止密码,导致多肽碱基序列改变而产生终止密码,导致多肽链非正常终止称为链非正常终止称为无义突变无义突变。2.3 Nonsence MutationnDNA碱基序列改变导致读码框的位移,使翻译碱基序列改变导致读码框的位移,使翻译的蛋白质成为无生物学活性的分子称为的蛋白质成为无生物学活性的分子称为移码突移码突变变。2.4 Frame-shift Mutationn基因突变后,再经二次突变,其生物学功能完基因突变后,再经二次突变,其生物学功能完全恢复,称为全恢复,称为回复突变回复突变(reve
6、rse mutation)。)。n基因经第二次突变后,产生的突变效应只是对基因经第二次突变后,产生的突变效应只是对第一次突变的补偿,则称为第一次突变的补偿,则称为校正抑制突变校正抑制突变(suppression mutation)。)。3.Reverse of Mutation EffectsSuppression Mutation of arc Gene from Phage P22arc(Am)mutant in a sup0 strain Wild-type arc+in a sup0 strain arc(Am)mutant in a supD strain with a suppre
7、ssor mutation in tRNAser n基因组基因组DNA分子中各部位发生的突变的机率不分子中各部位发生的突变的机率不同,突变频率明显高于其他部位的突变区被称同,突变频率明显高于其他部位的突变区被称为为突变热点突变热点。n许多突变热点源于甲基化修饰的碱基,特别是许多突变热点源于甲基化修饰的碱基,特别是发生于发生于CpG岛。岛。4.Mutation Hotspotsn对于二倍体生物,决定其表型的某种生物活性对于二倍体生物,决定其表型的某种生物活性物质的合成仅由一对等位基因控制。物质的合成仅由一对等位基因控制。5.Relationship of Alleles Mutation wit
8、h Phenotype5.1 Single Alleles野生型纯合子野生型纯合子 野生表型野生表型突变型纯合子突变型纯合子 突变表型突变表型野生型野生型-突变型杂合子突变型杂合子突变表型突变表型野生表型野生表型n在一个基因座位上存在两个及以上的等位基因,在一个基因座位上存在两个及以上的等位基因,每一对等位基因均有一定程度的变异;但这种每一对等位基因均有一定程度的变异;但这种变异对其功能没有影响,只是产生不同的表型,变异对其功能没有影响,只是产生不同的表型,如决定某种颜色的等位基因。如决定某种颜色的等位基因。5.2 Multiple Allelesn在某一种群基因组的座位上,存在多种不同的在某
9、一种群基因组的座位上,存在多种不同的等位基因,从而决定不同的遗传表型,称为等等位基因,从而决定不同的遗传表型,称为等位基因的遗传多态性,如决定位基因的遗传多态性,如决定ABO血型的等位血型的等位基因。基因。5.3 Alleles Polymorphism6.Dynamic Mutationn串联的三核苷酸重复拷贝数可随世代递增而出串联的三核苷酸重复拷贝数可随世代递增而出现累加效应的突变,称为现累加效应的突变,称为动态突变动态突变。n在多种神经变性疾病中都存在三核苷酸的不稳在多种神经变性疾病中都存在三核苷酸的不稳定扩展,其中以定扩展,其中以CAG重复扩展导致的疾病较多。重复扩展导致的疾病较多。n
10、CAG重复扩展序列在各自的编码基因中产生一重复扩展序列在各自的编码基因中产生一段多聚谷氨酰胺链。段多聚谷氨酰胺链。Repeat Expansion MutationRepeat Expansion Mutation of Dystrophia Myotonica Protein Kinase Gene强直性肌营养不良强直性肌营养不良Section 3 Results of Gene Mutation1.Biological Evolutionn基因突变是生物进化的源泉。基因突变是生物进化的源泉。n通过基因突变,可对现存基因进行改造,也可通过基因突变,可对现存基因进行改造,也可产生新的基因。产生
11、新的基因。2.Genetic Diseasesn对于高等生物来说,有利的基因突变是很少的。对于高等生物来说,有利的基因突变是很少的。因此,基因突变的后果常常是引起人类的遗传因此,基因突变的后果常常是引起人类的遗传性疾病。性疾病。n目前已知人类有目前已知人类有8000多种疾病与基因突变有关,多种疾病与基因突变有关,包括镰刀状红细胞贫血、苯丙酮酸尿症等。包括镰刀状红细胞贫血、苯丙酮酸尿症等。3.Cell Cancerationn与癌症发生直接相关的基因包括癌基因和抑癌与癌症发生直接相关的基因包括癌基因和抑癌基因,各种物理的、化学的或生物的诱变剂可基因,各种物理的、化学的或生物的诱变剂可使这些基因发
12、生突变,从而引起细胞癌变。使这些基因发生突变,从而引起细胞癌变。Section 4 Site-directed Mutagenesisn对已克隆基因或对已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱片段中的任何一个特定碱基,在体外条件下人工诱发碱基的取代、插入基,在体外条件下人工诱发碱基的取代、插入或缺失变化的过程称为基因的或缺失变化的过程称为基因的定点诱变技术。定点诱变技术。n定点诱变技术定点诱变技术是进行基因工程和蛋白质工程的是进行基因工程和蛋白质工程的重要手段。重要手段。1.Site-directed Mutagenesis Directed by Oligonucleotide n利用一段人
13、工合成的含有突变序列的寡核苷酸利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列,从而达片段,取代野生型基因中的相应序列,从而达到定点突变的目的,称为到定点突变的目的,称为盒式诱变盒式诱变。n实施盒式诱变时,要求靶实施盒式诱变时,要求靶DNA插入点两侧有合插入点两侧有合适的限制酶单一切点。适的限制酶单一切点。1.1 Cassette MutagenesisProcess of Cassette MutagenesisAn Example of Cassette Mutagenesis1.2 Doped Cassette Mutagenesisn粘性盒式诱变粘性盒式诱变通常
14、同时设计并合成两套带突变通常同时设计并合成两套带突变碱基的寡核苷酸单链,然后在碱基的寡核苷酸单链,然后在DNA聚合酶的催聚合酶的催化下进行重叠延伸,用限制酶切断后,可获得化下进行重叠延伸,用限制酶切断后,可获得两套双链的寡核苷酸片段,即可用于取代原有两套双链的寡核苷酸片段,即可用于取代原有的目的基因片段。的目的基因片段。n此法可提高基因诱变的效率。此法可提高基因诱变的效率。Doped Cassette Mutagenesisn利用一段含有突变序列的寡核苷酸片段作为利用一段含有突变序列的寡核苷酸片段作为引物,经引物,经DNA复制过程合成靶复制过程合成靶DNA片段,使片段,使其子代链发生突变,称为
15、其子代链发生突变,称为引物诱变引物诱变。1.3 Primer Mutagenesisn引物诱变的基本操作步骤:引物诱变的基本操作步骤:获得单链目的基因;获得单链目的基因;人工合成带突变序列的引物;人工合成带突变序列的引物;制备异源双链制备异源双链DNA;转染宿主细胞;转染宿主细胞;筛选重组体;筛选重组体;突变基因的鉴定和回收。突变基因的鉴定和回收。Process of Primer Mediated Mutagenesis1.4 QuikChange Primer Mutagenesisn这是由这是由Stratagene公司开发的一种引物定点公司开发的一种引物定点诱变法,该法的操作步骤如下:诱
16、变法,该法的操作步骤如下:将带目的基因的重组体在将带目的基因的重组体在dam+菌株中扩增,菌株中扩增,使使DNA序列被序列被dam甲基化酶所修饰;甲基化酶所修饰;使用带突变碱基的寡核苷酸引物,在较高使用带突变碱基的寡核苷酸引物,在较高温度下复制子代链,形成双链突变体;温度下复制子代链,形成双链突变体;用限制酶用限制酶Dpn将带甲基化标记的亲代双将带甲基化标记的亲代双链水解;链水解;将突变体转化宿主细胞。将突变体转化宿主细胞。Process of QuikChange Primer Mutagenesis1.5 The Kunkel Mutagenesis Methodn这是这是1985年由年由
17、Kunkel等人建立的一种寡核等人建立的一种寡核苷酸引物诱变法,该法的操作步骤如下:苷酸引物诱变法,该法的操作步骤如下:将复制型的将复制型的M13噬菌体转染到噬菌体转染到脱氧尿苷三脱氧尿苷三磷酸酶磷酸酶和和尿嘧啶脱糖苷酶尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷的双缺陷的E.coli(dut-,ung-)菌株中生长,使)菌株中生长,使U取代取代T掺掺入到入到DNA链中(一般每个重组体链中(一般每个重组体2030个);个);以此种带以此种带U的的DNA链为模板,用带突变碱链为模板,用带突变碱基的寡核苷酸引物进行复制,产生异源双基的寡核苷酸引物进行复制,产生异源双链;链;将此异源双链转化到将此异源双链转化到ung+(尿
18、嘧啶脱糖苷(尿嘧啶脱糖苷酶阳性)菌株中生长,含酶阳性)菌株中生长,含U的模板链被破的模板链被破坏,从而使子代坏,从而使子代DNA链大部分(链大部分(80%)含突变碱基序列。含突变碱基序列。Process of The Kunkel Mutagenesis1.6 Primer Mutagenesis with Restriction Enzyme Site Eliminationn限制酶位点消除引物诱变技术限制酶位点消除引物诱变技术是一种利用某些是一种利用某些限制酶不能切割由硫代磷酸核苷酸衍生物取代限制酶不能切割由硫代磷酸核苷酸衍生物取代正常碱基所形成的正常碱基所形成的DNA片段的特性,去除不含
19、片段的特性,去除不含突变碱基的亲代模板链,以提高定点突变效率突变碱基的亲代模板链,以提高定点突变效率的技术方法。的技术方法。n限制酶位点消除法的操作步骤是:限制酶位点消除法的操作步骤是:将带突变碱基的寡核苷酸引物与重组体单链将带突变碱基的寡核苷酸引物与重组体单链模板退火后,加入硫代磷酸核苷酸衍生物进模板退火后,加入硫代磷酸核苷酸衍生物进行复制,产生具有行复制,产生具有硫代磷酸核苷酸硫代磷酸核苷酸的异源双的异源双链链DNA;用特定的限制酶在此异源双链用特定的限制酶在此异源双链DNA上作切口,上作切口,此时亲代模板链由于无硫代磷酸核苷酸而被此时亲代模板链由于无硫代磷酸核苷酸而被切开,而新合成的子代
20、链则无法切割。切开,而新合成的子代链则无法切割。使用核酸外切酶将亲代模板链全部水解去使用核酸外切酶将亲代模板链全部水解去除,然后再以含除,然后再以含硫代磷酸核苷酸硫代磷酸核苷酸的子代单的子代单链为模板,经二次复制合成双链。链为模板,经二次复制合成双链。Primer Mutagenesis with RE-Site Elimination2.Site-directed Mutagenesis by PCRn将所使用的引物之一进行定点碱基突变后,作将所使用的引物之一进行定点碱基突变后,作第一轮第一轮PCR扩增。扩增。n将第一轮扩增产物作为第二轮将第一轮扩增产物作为第二轮PCR扩增的引物扩增的引物来
21、使用,从而使第二轮扩增的产物带突变的碱来使用,从而使第二轮扩增的产物带突变的碱基。基。2.1.1 Megaprimer Extension PCR Mutagenesis2.1 Base Substitution MutagenesisMegaprimer Extension PCR Mutagenesis2.1.2 Overlap Extension PCR Mutagenesisn使用带突变碱基的互补引物对两段目的基因序使用带突变碱基的互补引物对两段目的基因序列分别进行第一轮列分别进行第一轮PCR扩增;扩增;n将扩增产物进行重叠退火延伸,获得带突变碱将扩增产物进行重叠退火延伸,获得带突变碱
22、基的完整序列;基的完整序列;n使用该完整序列的两端引物进行第二轮使用该完整序列的两端引物进行第二轮PCR扩扩增。增。Overlap Extension PCR Mutagenesis2.2 Deletion PCR Mutagenesisn用于用于PCR扩增的引物中存在人为的扩增的引物中存在人为的DNA片段的片段的缺失,这样就会在缺失,这样就会在PCR扩增后的产物中引入此扩增后的产物中引入此缺失。缺失。n此法适用于在扩增此法适用于在扩增DNA序列的末端制造缺失序序列的末端制造缺失序列的情况。列的情况。2.2.1 Deletion Mutagenesis Using Mismatch Prime
23、rDeletion Mutagenesis Using Mismatch Primer2.2.2 Deletion Mutagenesis by PCR Fusionn使用两套引物分别扩增欲缺失片段两侧的序列使用两套引物分别扩增欲缺失片段两侧的序列(此两套引物的(此两套引物的5-端序列互补);端序列互补);n利用两套扩增产物利用两套扩增产物5-端的互补序列进行退火端的互补序列进行退火重叠并进行第二轮重叠并进行第二轮PCR延伸,获得完整的突变延伸,获得完整的突变体。体。Deletion Mutagenesis by PCR Fusion2.2.3 Deletion Mutagenesis by
24、Inverted PCRn将带目的基因的将带目的基因的DNA重组体作为模板进行重组体作为模板进行PCR扩增,所设计的一对引物与目的基因的两侧序扩增,所设计的一对引物与目的基因的两侧序列互补(不包括需缺失的序列)并向载体列互补(不包括需缺失的序列)并向载体DNA方向进行扩增;方向进行扩增;n扩增后的线性产物依靠两侧的互补序列重新退扩增后的线性产物依靠两侧的互补序列重新退火并连接成环状的双链火并连接成环状的双链DNA。Deletion Mutagenesis by Inverted PCR2.3 Insertion PCR Mutagenesisn使用使用5-端带有与目的基因互补的一对引物来端带有
25、与目的基因互补的一对引物来对欲插入的对欲插入的DNA片段进行片段进行PCR扩增;扩增;n将扩增产物与单链的目的基因重组体进行退火、将扩增产物与单链的目的基因重组体进行退火、延伸并连接,生成异源双链的重组体;延伸并连接,生成异源双链的重组体;n转化宿主细胞以获得带有新插入序列的双链重转化宿主细胞以获得带有新插入序列的双链重组体。组体。2.3.1 Insertion Mutagenesis by PCR Recombination Insertion Mutagenesis by PCR Recombination 3.3.2 Insertion Mutagenesis by PCR Overla
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