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类型分子生物学:基因突变2-研究生课件知识讲解.ppt

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    关 键  词:
    分子生物学 基因突变 研究生 课件 知识 讲解
    资源描述:

    1、Chapter 11 Gene MutationSection 1 Basic Concept of Gene Mutationn任何因素引起基因组任何因素引起基因组DNA分子一级结构的异常分子一级结构的异常改变,并导致生物个体表型的改变,称为改变,并导致生物个体表型的改变,称为基因基因突变(突变(gene mutation)。n根据引起基因突变的原因,可将其分为根据引起基因突变的原因,可将其分为自发突自发突变(变(spontaneous mutation)和和诱发突变诱发突变(induced mutation)。n根据发生基因突变的细胞的不同,可将其分为根据发生基因突变的细胞的不同,可将其分

    2、为生殖细胞突变(生殖细胞突变(germ cell mutation)和和体细体细胞突变(胞突变(somatic mutation)。Section 2 Classification and Characteristics of Gene Mutation1.Type of Gene Mutationn主要根据主要根据DNA一级结构改变情况分类。一级结构改变情况分类。可分为可分为单点突变单点突变(single point mutation)和和多点突变多点突变(multiple point mutation)。)。点突变的形式包括点突变的形式包括转换转换(transition)、)、颠颠换换(t

    3、ransversion)、)、插入插入(insertion)、)、缺失缺失(deletion)等。)等。1.1 Point Mutationn基因组基因组DNA中插入了其他的中插入了其他的DNA小片段,导致小片段,导致读码框改变或基因失活。读码框改变或基因失活。1.2 Insertion Mutation of DNA Fragmentn基因组基因组DNA中丢失了小片段中丢失了小片段DNA,导致读码框,导致读码框改变或基因失活。改变或基因失活。1.3 Deletion Mutation of DNA FragmentnDNA碱基改变后,形成相应的简并密码,其编碱基改变后,形成相应的简并密码,其

    4、编码的多肽链氨基酸序列不发生改变,称为码的多肽链氨基酸序列不发生改变,称为同义同义突变突变。2.Results of Gene Mutation2.1 Synonymous MutationnDNA碱基序列改变导致其编码的多肽链氨基酸碱基序列改变导致其编码的多肽链氨基酸序列改变,称为序列改变,称为错义突变错义突变。n错义突变后的编码产物仍然保留部分生物学活性,错义突变后的编码产物仍然保留部分生物学活性,则称为则称为渗漏突变渗漏突变(leaky mutation)。)。n错义突变后的编码产物如能全部保留原有生物学错义突变后的编码产物如能全部保留原有生物学活性,则称为活性,则称为中性突变中性突变(

    5、neutral mutation)。)。2.2 Missence MutationnDNA碱基序列改变而产生终止密码,导致多肽碱基序列改变而产生终止密码,导致多肽链非正常终止称为链非正常终止称为无义突变无义突变。2.3 Nonsence MutationnDNA碱基序列改变导致读码框的位移,使翻译碱基序列改变导致读码框的位移,使翻译的蛋白质成为无生物学活性的分子称为的蛋白质成为无生物学活性的分子称为移码突移码突变变。2.4 Frame-shift Mutationn基因突变后,再经二次突变,其生物学功能完基因突变后,再经二次突变,其生物学功能完全恢复,称为全恢复,称为回复突变回复突变(reve

    6、rse mutation)。)。n基因经第二次突变后,产生的突变效应只是对基因经第二次突变后,产生的突变效应只是对第一次突变的补偿,则称为第一次突变的补偿,则称为校正抑制突变校正抑制突变(suppression mutation)。)。3.Reverse of Mutation EffectsSuppression Mutation of arc Gene from Phage P22arc(Am)mutant in a sup0 strain Wild-type arc+in a sup0 strain arc(Am)mutant in a supD strain with a suppre

    7、ssor mutation in tRNAser n基因组基因组DNA分子中各部位发生的突变的机率不分子中各部位发生的突变的机率不同,突变频率明显高于其他部位的突变区被称同,突变频率明显高于其他部位的突变区被称为为突变热点突变热点。n许多突变热点源于甲基化修饰的碱基,特别是许多突变热点源于甲基化修饰的碱基,特别是发生于发生于CpG岛。岛。4.Mutation Hotspotsn对于二倍体生物,决定其表型的某种生物活性对于二倍体生物,决定其表型的某种生物活性物质的合成仅由一对等位基因控制。物质的合成仅由一对等位基因控制。5.Relationship of Alleles Mutation wit

    8、h Phenotype5.1 Single Alleles野生型纯合子野生型纯合子 野生表型野生表型突变型纯合子突变型纯合子 突变表型突变表型野生型野生型-突变型杂合子突变型杂合子突变表型突变表型野生表型野生表型n在一个基因座位上存在两个及以上的等位基因,在一个基因座位上存在两个及以上的等位基因,每一对等位基因均有一定程度的变异;但这种每一对等位基因均有一定程度的变异;但这种变异对其功能没有影响,只是产生不同的表型,变异对其功能没有影响,只是产生不同的表型,如决定某种颜色的等位基因。如决定某种颜色的等位基因。5.2 Multiple Allelesn在某一种群基因组的座位上,存在多种不同的在某

    9、一种群基因组的座位上,存在多种不同的等位基因,从而决定不同的遗传表型,称为等等位基因,从而决定不同的遗传表型,称为等位基因的遗传多态性,如决定位基因的遗传多态性,如决定ABO血型的等位血型的等位基因。基因。5.3 Alleles Polymorphism6.Dynamic Mutationn串联的三核苷酸重复拷贝数可随世代递增而出串联的三核苷酸重复拷贝数可随世代递增而出现累加效应的突变,称为现累加效应的突变,称为动态突变动态突变。n在多种神经变性疾病中都存在三核苷酸的不稳在多种神经变性疾病中都存在三核苷酸的不稳定扩展,其中以定扩展,其中以CAG重复扩展导致的疾病较多。重复扩展导致的疾病较多。n

    10、CAG重复扩展序列在各自的编码基因中产生一重复扩展序列在各自的编码基因中产生一段多聚谷氨酰胺链。段多聚谷氨酰胺链。Repeat Expansion MutationRepeat Expansion Mutation of Dystrophia Myotonica Protein Kinase Gene强直性肌营养不良强直性肌营养不良Section 3 Results of Gene Mutation1.Biological Evolutionn基因突变是生物进化的源泉。基因突变是生物进化的源泉。n通过基因突变,可对现存基因进行改造,也可通过基因突变,可对现存基因进行改造,也可产生新的基因。产生

    11、新的基因。2.Genetic Diseasesn对于高等生物来说,有利的基因突变是很少的。对于高等生物来说,有利的基因突变是很少的。因此,基因突变的后果常常是引起人类的遗传因此,基因突变的后果常常是引起人类的遗传性疾病。性疾病。n目前已知人类有目前已知人类有8000多种疾病与基因突变有关,多种疾病与基因突变有关,包括镰刀状红细胞贫血、苯丙酮酸尿症等。包括镰刀状红细胞贫血、苯丙酮酸尿症等。3.Cell Cancerationn与癌症发生直接相关的基因包括癌基因和抑癌与癌症发生直接相关的基因包括癌基因和抑癌基因,各种物理的、化学的或生物的诱变剂可基因,各种物理的、化学的或生物的诱变剂可使这些基因发

    12、生突变,从而引起细胞癌变。使这些基因发生突变,从而引起细胞癌变。Section 4 Site-directed Mutagenesisn对已克隆基因或对已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱片段中的任何一个特定碱基,在体外条件下人工诱发碱基的取代、插入基,在体外条件下人工诱发碱基的取代、插入或缺失变化的过程称为基因的或缺失变化的过程称为基因的定点诱变技术。定点诱变技术。n定点诱变技术定点诱变技术是进行基因工程和蛋白质工程的是进行基因工程和蛋白质工程的重要手段。重要手段。1.Site-directed Mutagenesis Directed by Oligonucleotide n利用一段人

    13、工合成的含有突变序列的寡核苷酸利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列,从而达片段,取代野生型基因中的相应序列,从而达到定点突变的目的,称为到定点突变的目的,称为盒式诱变盒式诱变。n实施盒式诱变时,要求靶实施盒式诱变时,要求靶DNA插入点两侧有合插入点两侧有合适的限制酶单一切点。适的限制酶单一切点。1.1 Cassette MutagenesisProcess of Cassette MutagenesisAn Example of Cassette Mutagenesis1.2 Doped Cassette Mutagenesisn粘性盒式诱变粘性盒式诱变通常

    14、同时设计并合成两套带突变通常同时设计并合成两套带突变碱基的寡核苷酸单链,然后在碱基的寡核苷酸单链,然后在DNA聚合酶的催聚合酶的催化下进行重叠延伸,用限制酶切断后,可获得化下进行重叠延伸,用限制酶切断后,可获得两套双链的寡核苷酸片段,即可用于取代原有两套双链的寡核苷酸片段,即可用于取代原有的目的基因片段。的目的基因片段。n此法可提高基因诱变的效率。此法可提高基因诱变的效率。Doped Cassette Mutagenesisn利用一段含有突变序列的寡核苷酸片段作为利用一段含有突变序列的寡核苷酸片段作为引物,经引物,经DNA复制过程合成靶复制过程合成靶DNA片段,使片段,使其子代链发生突变,称为

    15、其子代链发生突变,称为引物诱变引物诱变。1.3 Primer Mutagenesisn引物诱变的基本操作步骤:引物诱变的基本操作步骤:获得单链目的基因;获得单链目的基因;人工合成带突变序列的引物;人工合成带突变序列的引物;制备异源双链制备异源双链DNA;转染宿主细胞;转染宿主细胞;筛选重组体;筛选重组体;突变基因的鉴定和回收。突变基因的鉴定和回收。Process of Primer Mediated Mutagenesis1.4 QuikChange Primer Mutagenesisn这是由这是由Stratagene公司开发的一种引物定点公司开发的一种引物定点诱变法,该法的操作步骤如下:诱

    16、变法,该法的操作步骤如下:将带目的基因的重组体在将带目的基因的重组体在dam+菌株中扩增,菌株中扩增,使使DNA序列被序列被dam甲基化酶所修饰;甲基化酶所修饰;使用带突变碱基的寡核苷酸引物,在较高使用带突变碱基的寡核苷酸引物,在较高温度下复制子代链,形成双链突变体;温度下复制子代链,形成双链突变体;用限制酶用限制酶Dpn将带甲基化标记的亲代双将带甲基化标记的亲代双链水解;链水解;将突变体转化宿主细胞。将突变体转化宿主细胞。Process of QuikChange Primer Mutagenesis1.5 The Kunkel Mutagenesis Methodn这是这是1985年由年由

    17、Kunkel等人建立的一种寡核等人建立的一种寡核苷酸引物诱变法,该法的操作步骤如下:苷酸引物诱变法,该法的操作步骤如下:将复制型的将复制型的M13噬菌体转染到噬菌体转染到脱氧尿苷三脱氧尿苷三磷酸酶磷酸酶和和尿嘧啶脱糖苷酶尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷的双缺陷的E.coli(dut-,ung-)菌株中生长,使)菌株中生长,使U取代取代T掺掺入到入到DNA链中(一般每个重组体链中(一般每个重组体2030个);个);以此种带以此种带U的的DNA链为模板,用带突变碱链为模板,用带突变碱基的寡核苷酸引物进行复制,产生异源双基的寡核苷酸引物进行复制,产生异源双链;链;将此异源双链转化到将此异源双链转化到ung+(尿

    18、嘧啶脱糖苷(尿嘧啶脱糖苷酶阳性)菌株中生长,含酶阳性)菌株中生长,含U的模板链被破的模板链被破坏,从而使子代坏,从而使子代DNA链大部分(链大部分(80%)含突变碱基序列。含突变碱基序列。Process of The Kunkel Mutagenesis1.6 Primer Mutagenesis with Restriction Enzyme Site Eliminationn限制酶位点消除引物诱变技术限制酶位点消除引物诱变技术是一种利用某些是一种利用某些限制酶不能切割由硫代磷酸核苷酸衍生物取代限制酶不能切割由硫代磷酸核苷酸衍生物取代正常碱基所形成的正常碱基所形成的DNA片段的特性,去除不含

    19、片段的特性,去除不含突变碱基的亲代模板链,以提高定点突变效率突变碱基的亲代模板链,以提高定点突变效率的技术方法。的技术方法。n限制酶位点消除法的操作步骤是:限制酶位点消除法的操作步骤是:将带突变碱基的寡核苷酸引物与重组体单链将带突变碱基的寡核苷酸引物与重组体单链模板退火后,加入硫代磷酸核苷酸衍生物进模板退火后,加入硫代磷酸核苷酸衍生物进行复制,产生具有行复制,产生具有硫代磷酸核苷酸硫代磷酸核苷酸的异源双的异源双链链DNA;用特定的限制酶在此异源双链用特定的限制酶在此异源双链DNA上作切口,上作切口,此时亲代模板链由于无硫代磷酸核苷酸而被此时亲代模板链由于无硫代磷酸核苷酸而被切开,而新合成的子代

    20、链则无法切割。切开,而新合成的子代链则无法切割。使用核酸外切酶将亲代模板链全部水解去使用核酸外切酶将亲代模板链全部水解去除,然后再以含除,然后再以含硫代磷酸核苷酸硫代磷酸核苷酸的子代单的子代单链为模板,经二次复制合成双链。链为模板,经二次复制合成双链。Primer Mutagenesis with RE-Site Elimination2.Site-directed Mutagenesis by PCRn将所使用的引物之一进行定点碱基突变后,作将所使用的引物之一进行定点碱基突变后,作第一轮第一轮PCR扩增。扩增。n将第一轮扩增产物作为第二轮将第一轮扩增产物作为第二轮PCR扩增的引物扩增的引物来

    21、使用,从而使第二轮扩增的产物带突变的碱来使用,从而使第二轮扩增的产物带突变的碱基。基。2.1.1 Megaprimer Extension PCR Mutagenesis2.1 Base Substitution MutagenesisMegaprimer Extension PCR Mutagenesis2.1.2 Overlap Extension PCR Mutagenesisn使用带突变碱基的互补引物对两段目的基因序使用带突变碱基的互补引物对两段目的基因序列分别进行第一轮列分别进行第一轮PCR扩增;扩增;n将扩增产物进行重叠退火延伸,获得带突变碱将扩增产物进行重叠退火延伸,获得带突变碱

    22、基的完整序列;基的完整序列;n使用该完整序列的两端引物进行第二轮使用该完整序列的两端引物进行第二轮PCR扩扩增。增。Overlap Extension PCR Mutagenesis2.2 Deletion PCR Mutagenesisn用于用于PCR扩增的引物中存在人为的扩增的引物中存在人为的DNA片段的片段的缺失,这样就会在缺失,这样就会在PCR扩增后的产物中引入此扩增后的产物中引入此缺失。缺失。n此法适用于在扩增此法适用于在扩增DNA序列的末端制造缺失序序列的末端制造缺失序列的情况。列的情况。2.2.1 Deletion Mutagenesis Using Mismatch Prime

    23、rDeletion Mutagenesis Using Mismatch Primer2.2.2 Deletion Mutagenesis by PCR Fusionn使用两套引物分别扩增欲缺失片段两侧的序列使用两套引物分别扩增欲缺失片段两侧的序列(此两套引物的(此两套引物的5-端序列互补);端序列互补);n利用两套扩增产物利用两套扩增产物5-端的互补序列进行退火端的互补序列进行退火重叠并进行第二轮重叠并进行第二轮PCR延伸,获得完整的突变延伸,获得完整的突变体。体。Deletion Mutagenesis by PCR Fusion2.2.3 Deletion Mutagenesis by

    24、Inverted PCRn将带目的基因的将带目的基因的DNA重组体作为模板进行重组体作为模板进行PCR扩增,所设计的一对引物与目的基因的两侧序扩增,所设计的一对引物与目的基因的两侧序列互补(不包括需缺失的序列)并向载体列互补(不包括需缺失的序列)并向载体DNA方向进行扩增;方向进行扩增;n扩增后的线性产物依靠两侧的互补序列重新退扩增后的线性产物依靠两侧的互补序列重新退火并连接成环状的双链火并连接成环状的双链DNA。Deletion Mutagenesis by Inverted PCR2.3 Insertion PCR Mutagenesisn使用使用5-端带有与目的基因互补的一对引物来端带有

    25、与目的基因互补的一对引物来对欲插入的对欲插入的DNA片段进行片段进行PCR扩增;扩增;n将扩增产物与单链的目的基因重组体进行退火、将扩增产物与单链的目的基因重组体进行退火、延伸并连接,生成异源双链的重组体;延伸并连接,生成异源双链的重组体;n转化宿主细胞以获得带有新插入序列的双链重转化宿主细胞以获得带有新插入序列的双链重组体。组体。2.3.1 Insertion Mutagenesis by PCR Recombination Insertion Mutagenesis by PCR Recombination 3.3.2 Insertion Mutagenesis by PCR Overla

    26、p Extension n设计并合成两套用于设计并合成两套用于PCR扩增的引物,分别用扩增的引物,分别用于目的基因两侧半序列的扩增,但在这两套引于目的基因两侧半序列的扩增,但在这两套引物的物的5-端均添加了欲插入的互补序列;端均添加了欲插入的互补序列;n经经PCR扩增后的产物,通过此互补序列进行重扩增后的产物,通过此互补序列进行重叠延伸,生成完整的双链叠延伸,生成完整的双链DNA,即可将新的序,即可将新的序列引入目的基因中。列引入目的基因中。Insertion Mutagenesis by PCR Overlap Extension2.4 Error Prone(Sloppy)PCR Muta

    27、genesisn错误倾向错误倾向PCR诱变诱变是是通过增加通过增加Mg2+和和Taq DNA聚合酶的浓度,聚合酶的浓度,使使PCR扩增过程中复扩增过程中复制错配率增加而随机制错配率增加而随机产生碱基突变。产生碱基突变。4.Application of Site-directed Mutagenesis 研究基因的结构与功能之间的关系;研究基因的结构与功能之间的关系;研究研究DNA-蛋白质,蛋白质蛋白质,蛋白质-蛋白质的相互作蛋白质的相互作用关系;用关系;蛋白质工程。蛋白质工程。Chapter 13 Tumor-associated Genesn肿瘤细胞是一种不受体内生长调控系统的控制肿瘤细胞是

    28、一种不受体内生长调控系统的控制而自主生长增殖,并可发生侵袭和转移的恶性而自主生长增殖,并可发生侵袭和转移的恶性细胞。细胞。n目前已知,肿瘤的发生、发展与目前已知,肿瘤的发生、发展与癌基因(癌基因(on-cogene)和和抑癌基因(抑癌基因(tumor suppressor gene)的结构和功能改变密切相关。的结构和功能改变密切相关。Section 1 Oncogene and Proto-oncogene1.Discovery and Concept of Oncogenen1911年年 Reyton Rous 将鸡肉瘤的无细胞滤液将鸡肉瘤的无细胞滤液注射给鸡后,可诱导发生肉瘤,说明无细胞滤

    29、注射给鸡后,可诱导发生肉瘤,说明无细胞滤液中的感染颗粒是引起液中的感染颗粒是引起 Rous鸡肉瘤的原因,鸡肉瘤的原因,这种感染性颗粒后来被证实是逆转录病毒。这种感染性颗粒后来被证实是逆转录病毒。n追踪研究逆转录病毒致癌的线索,追踪研究逆转录病毒致癌的线索,Bishop等等人于人于1980年提出了年提出了癌基因假说癌基因假说。n根据这一假说,引起根据这一假说,引起Rous鸡肉瘤等的逆转录鸡肉瘤等的逆转录病毒的基因组中存在有致癌基因(即病毒癌基病毒的基因组中存在有致癌基因(即病毒癌基因,因,v-onc)。)。n存在于正常细胞中与病毒癌基因具有同源顺序存在于正常细胞中与病毒癌基因具有同源顺序的基因则

    30、被称为的基因则被称为细胞癌基因(细胞癌基因(c-onc)。nc-onc在正常细胞中一般以非激活形式存在,在正常细胞中一般以非激活形式存在,参与细胞的生长、分化与凋亡的调控,故又称参与细胞的生长、分化与凋亡的调控,故又称为为原癌基因(原癌基因(proto-oncogene)。n因此,因此,癌基因(癌基因(oncogene)就是存在于正常就是存在于正常细胞中,能够编码生长因子、生长因子受体、细胞中,能够编码生长因子、生长因子受体、细胞内信息分子及转录因子的基因,即编码关细胞内信息分子及转录因子的基因,即编码关键性调控蛋白的正常细胞基因。键性调控蛋白的正常细胞基因。2.Classification

    31、and Function of Oncogenen目前发现的癌基因已超过目前发现的癌基因已超过100种,主要根据癌基因种,主要根据癌基因表达产物的结构、功能和亚细胞定位进行分类:表达产物的结构、功能和亚细胞定位进行分类:生长因子类;生长因子类;生长因子受体类;生长因子受体类;酪氨酸蛋白激酶类;酪氨酸蛋白激酶类;丝氨酸苏氨酸蛋白激酶类;丝氨酸苏氨酸蛋白激酶类;GTP结合蛋白(结合蛋白(G蛋白)类;蛋白)类;核内转录因子类。核内转录因子类。2.1 The Class Related with Growth Factor PDGF-related Oncogenesv-sis和和c-sis癌基因的编

    32、码产物癌基因的编码产物p28sis,为,为分泌型蛋白质,由两条相同的多肽链组成,分泌型蛋白质,由两条相同的多肽链组成,与与PDGF的的 链同源,在功能上与链同源,在功能上与PDGF有有相同的效应。相同的效应。EGF-related OncogenesTGF-A癌基因编码分泌型转化因子(癌基因编码分泌型转化因子(TGF-),与,与EGF属同一家族,其作用的受体属同一家族,其作用的受体为癌基因为癌基因erbB编码的蛋白质。编码的蛋白质。FGF Family-related Oncogenes包括包括c-int-2、c-hst-1、FGF-5、FGF-6等等癌基因,其编码产物与癌基因,其编码产物与F

    33、GF同源。同源。EGFR-related Oncogenes包括包括c-erbB-1、c-erbB-2(neu)等癌基)等癌基因,其编码产物与因,其编码产物与EGF受体同源,但有结受体同源,但有结构上的改变,如丢失了受体构上的改变,如丢失了受体N-端的配体结端的配体结合结构域,使受体蛋白无需配体的刺激即合结构域,使受体蛋白无需配体的刺激即具有持续的活性。具有持续的活性。2.2 The Class Related with Growth Factor Receptor NGFR-related Oncogenesc-trk癌基因编码产物与癌基因编码产物与NGF受体同源,其受体同源,其膜外区被其他

    34、基因的编码序列所替代后产膜外区被其他基因的编码序列所替代后产生转化活性。生转化活性。CSFR-related Oncogenesc-fms癌基因编码产物与集落刺激因子受癌基因编码产物与集落刺激因子受体(体(CSF-1R)同源。)同源。Molecular Structure of Growth Factor Receptor Related with Oncoproteinsn此类癌基因的编码产物为具有酪氨酸蛋白激酶此类癌基因的编码产物为具有酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性的细胞生长信号转导蛋白,通常)活性的细胞生长信号转导蛋白,通常存在于胞浆或细胞核中。存在于胞浆或细胞核中。2.3 The Cla

    35、ss Related with Tyrosine Protein Kinase Src Family Oncogens包括包括c-src、c-yes、c-fgr、c-fyn等癌基等癌基因,其编码产物具有因,其编码产物具有TPK活性,一般借助活性,一般借助于于N-端的豆蔻酸而挂于细胞质膜上,可被端的豆蔻酸而挂于细胞质膜上,可被生长因子受体或细胞因子受体激活。生长因子受体或细胞因子受体激活。Inhibition of Phosphorylated Tyr527 for src Kinase Activityv-src is Missing a C-terminal Regulatory Domai

    36、n Abl Family Oncogenes包括包括c-abl、c-fes等癌基因,也具有等癌基因,也具有TPK活性,但游离存在于细胞核内,传递生长活性,但游离存在于细胞核内,传递生长刺激信号。刺激信号。n癌基因的编码产物具有癌基因的编码产物具有Ser/Thr蛋白激酶活性,蛋白激酶活性,并在生长信号传递过程中起作用。并在生长信号传递过程中起作用。Raf Family Oncogenes包括包括c-Raf-1、A-Raf、B-Raf、c-mos等癌基因,在等癌基因,在MAPK级联信号转导途径级联信号转导途径中起作用。中起作用。2.4 The Class Related with Ser/Thr

    37、Protein Kinase PKC Family Oncogenes编码编码12种不同的同工酶,可经磷酸化修饰种不同的同工酶,可经磷酸化修饰而激活而激活c-Raf-1,从而传递生长刺激信号。,从而传递生长刺激信号。n此类癌基因主要是此类癌基因主要是ras家族癌基因,包括家族癌基因,包括H-ras-1/2、K-ras-1/2、N-ras等。等。n此类癌基因编码小分子此类癌基因编码小分子G蛋白,具有蛋白,具有GTPase活性。其活性受到活性。其活性受到鸟苷酸交换因子(鸟苷酸交换因子(GEF)的的正调控和正调控和GTP酶激活蛋白(酶激活蛋白(GAP)的负调控。的负调控。2.5 The Class

    38、Related with GTP Binding Proteinn小分子小分子G蛋白,如蛋白,如Ras激活后可将生长刺激信激活后可将生长刺激信号传递给号传递给c-Raf-1。n如癌基因发生突变而使如癌基因发生突变而使G蛋白的蛋白的GTPase活性活性降低,则可导致该蛋白持续激活。降低,则可导致该蛋白持续激活。n此类癌基因的编码产物位于细胞核内,具有转此类癌基因的编码产物位于细胞核内,具有转录因子的结构与功能,参与细胞增殖的调控。录因子的结构与功能,参与细胞增殖的调控。2.6 The Class Related with Nuclear Transcription Factor Myc Fami

    39、ly Oncogenes包括包括c-myc、N-myc、L-myc等癌基因,等癌基因,其编码产物为转录因子,形成其编码产物为转录因子,形成myc-max异异源二聚体时具有激活基因表达的功能。源二聚体时具有激活基因表达的功能。Fos and Jun Oncogenes编码产物为编码产物为转录激活因子转录激活因子-1(AP-1)的的两个亚基,二者结合形成异二聚体后具两个亚基,二者结合形成异二聚体后具有激活基因转录的功能。有激活基因转录的功能。ErbA Oncogene编码产物为甲状腺激素受体。当该受体结编码产物为甲状腺激素受体。当该受体结合激素结构域缺失后,受体即具有持续激合激素结构域缺失后,受体

    40、即具有持续激活基因表达的作用。活基因表达的作用。其他还包括其他还包括myb、ets、rel、evi、spi等癌基等癌基因。因。3.Mechanisms of Proto-oncogene Activationn即原癌基因的结构发生改变,从而影响其功能即原癌基因的结构发生改变,从而影响其功能或生理活性,常见的有或生理活性,常见的有点突变点突变、缺失突变缺失突变和和插插入突变入突变等。等。3.1 Proto-oncogene Mutation3.1.1 Point Mutationn点突变常见于点突变常见于ras癌基因,点突变主要发生在癌基因,点突变主要发生在12、13、61或或63位氨基酸残基处

    41、。位氨基酸残基处。n发生点突变后的发生点突变后的Ras蛋白与蛋白与GTPase激活蛋白激活蛋白(GAP)的亲和力降低,从而使其的亲和力降低,从而使其GTPase活活性降低而处于持续激活状态(性降低而处于持续激活状态(Ras-GTP)。)。n缺失突变的典型例子是缺失突变的典型例子是c-erbB-1原癌基因和原癌基因和c-erbA原癌基因。原癌基因。nc-erbB-1原癌基因的编码产物与原癌基因的编码产物与EGFR同源,同源,其细胞外配体结合区发生缺失突变后,使受体其细胞外配体结合区发生缺失突变后,使受体处于持续激活状态。处于持续激活状态。3.1.2 Deletion Mutationnc-erb

    42、A原癌基因的编码产物与甲状腺激素受体原癌基因的编码产物与甲状腺激素受体同源,其配体结合区发生缺失突变后,受体的同源,其配体结合区发生缺失突变后,受体的转录活性和转录活性和DNA结合活性失去控制,从而持续结合活性失去控制,从而持续刺激基因表达。刺激基因表达。n此外,在逆转录病毒所携带的病毒癌基因中,此外,在逆转录病毒所携带的病毒癌基因中,也可见到因原癌基因缺失突变而激活的例子。也可见到因原癌基因缺失突变而激活的例子。n如如v-src病毒癌基因,是逆转录病毒在长期进病毒癌基因,是逆转录病毒在长期进化过程中,将宿主细胞中的化过程中,将宿主细胞中的c-src原癌基因转原癌基因转导并整合到其基因组中,并

    43、使其导并整合到其基因组中,并使其C-端发生缺失端发生缺失突变而激活为病毒癌基因,其编码产物具有持突变而激活为病毒癌基因,其编码产物具有持续续TPK活性。活性。n由于顺式作用元件,如启动子、增强子等插入由于顺式作用元件,如启动子、增强子等插入到原癌基因上游或附近而导致其激活并异常表到原癌基因上游或附近而导致其激活并异常表达;或由于其他基因片段的插入产生了新的融达;或由于其他基因片段的插入产生了新的融合基因,使其编码产物的生理功能发生异常改合基因,使其编码产物的生理功能发生异常改变而导致细胞转化。变而导致细胞转化。3.1.3 Insertion Mutationn逆转录病毒逆转录病毒的强启动子或强

    44、增强子序列常常插的强启动子或强增强子序列常常插入到某些原癌基因上游或附近,从而使该基因入到某些原癌基因上游或附近,从而使该基因异常表达而被激活。异常表达而被激活。n常见的有常见的有c-myc、c-sis、c-erbB、c-ras、c-myb等原癌基因。等原癌基因。Insertion Activation of c-myc Proto-oncogenen染色体的重排常常也会造成原癌基因易位到其染色体的重排常常也会造成原癌基因易位到其他基因的强启动子下游或强增强子附近而被激他基因的强启动子下游或强增强子附近而被激活。活。n在人类巴基特淋巴瘤的细胞系中,发现带在人类巴基特淋巴瘤的细胞系中,发现带c-

    45、myc原癌基因的第原癌基因的第8号染色体长臂远端片段易号染色体长臂远端片段易位至第位至第2,22和和14号染色体的一定部位,并位号染色体的一定部位,并位于免疫球蛋白轻链或重链基因于免疫球蛋白轻链或重链基因强启动子的下游强启动子的下游而被激活。而被激活。n除此之外,染色体重排也会使原癌基因易位并除此之外,染色体重排也会使原癌基因易位并插入到其他基因中,形成新的插入到其他基因中,形成新的融合基因融合基因,从而,从而引起该原癌基因表达的融合蛋白产物的功能改引起该原癌基因表达的融合蛋白产物的功能改变而被激活。变而被激活。n在慢性粒细胞性白血病细胞中,常常可见到的在慢性粒细胞性白血病细胞中,常常可见到的

    46、Ph1染色体,就是由于染色体,就是由于9号染色体与号染色体与22号染色号染色体重排所致。重排后,体重排所致。重排后,c-abl原癌基因与原癌基因与bcr基基因融合而被激活,其编码的因融合而被激活,其编码的abl-bcr融合蛋白融合蛋白具有持续的具有持续的TPK活性。活性。Ph1 Chromosome in CML Cells3.2 Proto-oncogene Amplificationn基因扩增引起原癌基因基因扩增引起原癌基因拷贝数目增加,导致染拷贝数目增加,导致染色体结构异常,常形成色体结构异常,常形成双微染色体(双微染色体(DM)或染)或染色体均染区(色体均染区(HSR),),其机制不明

    47、。其机制不明。DM and HSRB.homogeneous staining region(HSR)A.double minute chromosome(DM)n基因扩增常常导致原癌基因表达增强而被激活,基因扩增常常导致原癌基因表达增强而被激活,常见于常见于myc家族原癌基因。家族原癌基因。3.3 Alternation of Proto-oncogene Methylationn在肿瘤细胞中可发现原癌基因的甲基化修饰改在肿瘤细胞中可发现原癌基因的甲基化修饰改变,表现为原癌基因的低甲基化或去甲基化而变,表现为原癌基因的低甲基化或去甲基化而被激活。被激活。n如在胃癌细胞中发现了如在胃癌细胞中发

    48、现了c-Ha-ras癌基因的低甲癌基因的低甲基化修饰,而低甲基化可导致基化修饰,而低甲基化可导致c-Ha-ras癌基因癌基因的过度表达。的过度表达。Section 2 Tumor Suppressor Gene1.Discovery and Concept of Tumor Suppressor Genen20世纪世纪70年代初,在研究体细胞杂交时发现:年代初,在研究体细胞杂交时发现:肿瘤细胞与正常细胞进行融合,结果产生正常肿瘤细胞与正常细胞进行融合,结果产生正常的杂交细胞。的杂交细胞。n这种现象表明,在正常细胞中含有抑制肿瘤生这种现象表明,在正常细胞中含有抑制肿瘤生长,调节细胞正常生长的物质

    49、。长,调节细胞正常生长的物质。1.1 Discovery of Tumor Suppressor Genen1985年,年,Cavence等从两个患遗传性视网膜等从两个患遗传性视网膜母细胞瘤家族中,发现肿瘤细胞缺失了位于母细胞瘤家族中,发现肿瘤细胞缺失了位于13q14区的区的Rb基因,且当基因,且当Rb基因为纯合子时基因为纯合子时就会诱发肿瘤,从而首次发现并证实了抑癌基就会诱发肿瘤,从而首次发现并证实了抑癌基因。因。n抑癌基因抑癌基因(tumor suppressor gene),又称),又称抗癌基因抗癌基因(anti-oncogene)、)、肿瘤易感基因肿瘤易感基因或或隐性癌基因隐性癌基因,

    50、是一类存在于正常细胞中,其,是一类存在于正常细胞中,其编码产物能抑制细胞生长增殖的基因。编码产物能抑制细胞生长增殖的基因。n由于这类基因的缺失、突变或甲基化引起的失由于这类基因的缺失、突变或甲基化引起的失活,最终导致肿瘤的发生。活,最终导致肿瘤的发生。1.2 Concept of Tumor Suppressor Genen目前已被人们认识和克隆的抑癌基因有目前已被人们认识和克隆的抑癌基因有40多种,多种,可分为两大类:可分为两大类:抑制细胞增殖的抑癌基因;抑制细胞增殖的抑癌基因;参与参与DNA损伤修复的抑癌基因。损伤修复的抑癌基因。抑制细胞增殖的抑癌基因抑制细胞增殖的抑癌基因uRb reti

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