酵母蔗糖酶的提取分离纯化及其蛋白质浓度和酶活力测定(126)课件.ppt
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- 关 键 词:
- 酵母 蔗糖 提取 分离 纯化 及其 蛋白质 浓度 活力 测定 126 课件
- 资源描述:
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1、酵母蔗糖酶的提取、分离纯化及其酵母蔗糖酶的提取、分离纯化及其蛋白质浓度和酶活力测定蛋白质浓度和酶活力测定 蔗糖酶催化底物蔗糖分解成葡萄糖和果糖 蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式:l 存在于细胞膜外细胞壁中的高度糖基化的外蔗糖酶,其活 力占蔗糖酶活力的大部分,是含有50(质量分数)糖成 分的糖蛋白,该酶是蔗糖酶的主要形式l 存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的内蔗糖酶。本实验提取纯化的主要是外蔗糖酶酵母细胞结构图 酶是生物体内具有催化活性的物质,可据酶蛋白的结构和性质来选择分离提纯方法和含量测定。酶的分离提纯是为了提高纯度(或比活力)及收率;依据其性质(分子大小、溶解度、电荷、吸附等)进行分离;
2、同时用测定酶活力的方法了解酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。本实验由四个分实验组成:蔗糖酶的提取与初步纯化蔗糖酶各级分酶活力的测定蔗糖酶各级分酶蛋白质浓度的测定离子交换柱层析纯化蔗糖酶分实验一:蔗糖酶的提取与初步纯化一、实验目的 学习蔗糖酶分离提取的原理 学习掌握细胞破壁、有机溶剂沉淀蛋白质的原理与操作二、实验原理 细胞破碎的方法细胞破碎的方法高压匀浆破碎法(homogenization)振荡珠击破碎法(Skaking Bead)高速搅拌珠研磨破碎法(fine grinding)超声波破碎法(ultrasonication)机械法渗透压冲击破碎法(osmotic shock)冻融破碎法(fre
3、ezing and thawing)酶溶破碎法(enzyme lysis)化学破碎法(chemical treatment)去垢剂破碎法(detergents)非机械法蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀 蛋白质从溶液中以固体状态析出的现象蛋白质从溶液中以固体状态析出的现象作用机制主要是破坏了蛋白质水化膜或蛋白质所带的电荷主要沉淀方法:主要沉淀方法:盐沉淀蛋白质盐沉淀蛋白质盐析盐析 重金属盐沉淀蛋白质重金属盐沉淀蛋白质 某些酸类沉淀蛋白质某些酸类沉淀蛋白质 有机溶剂沉淀蛋白质有机溶剂沉淀蛋白质 乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂可破坏蛋白质的水化层,使蛋白质的溶解度下降;另一方面有机溶剂能降低溶液的介电常数,增加
4、蛋白质分子上不同电荷的引力,降低其溶解度,因此使之发生沉淀反应。如把溶液的pH 值调节到该蛋白质的等电点时,则沉淀更完善。在室温条件下,有机溶剂沉淀所得蛋白质往往已发生变性。若在低温条件下进行沉淀,则变性作用进行缓慢。利用机械法(二氧化硅研磨)破碎酵母细胞壁采用预冷的去离子水溶解破壁后释放出来的蔗糖酶离心去除酵母菌体而得到蔗糖酶溶液加热去除热不稳定的杂蛋白乙醇沉淀获得粗提酶。三、实验材料、仪器和试剂 实验材料:安琪酵母 仪器和试剂:研钵,离心管,滴管,量筒,恒温水浴锅,烧杯,高速冷冻离心机,pH值试纸 二氧化硅,去离子水,冰,食盐,1mol/L乙酸,95乙醇.四、操作步骤 提取(1)准备冰浴,
5、将研钵稳妥放入冰浴中(2)称取3g干酵母粉和5g 二氧化硅(石英砂),放入研钵中(3)用量筒量取30mL预冷的去离子水,先加5ml左右研磨(若不够每次用滴管再加2mL左右水),边加边研磨成糊状(至少用30 min),然后转移到100mL离心管中,最后用剩余的水洗净研钵中的物质并转移到离心管中,以便将蔗糖酶充分转入水相中。(4)平衡,4、10000rpm离心10min (5)将上清液倒入量筒,量出体积并记录,转入清洁烧杯中。(6)用pH试纸检查上清pH值,用1mol/L 乙酸将pH值调至5.0。(7)将其置于50的水浴,经常缓慢搅拌,30min。(8)于冰浴中迅速冷却,倒入100ml的离心管中,
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