单分子操作及其应用解析课件.ppt

1、单分子操作 及其应用 单分子操作技术 单分子操作与研究应用 存在的问题与解决途径单分子操作技术 单分子操作技术是指应用一定的实验仪器和方法，在单分子水平上对生物大分子的行为（包括构象变化、相互作用、相互识别等）进行实时动态检测以及在此基础上的操纵调控等，是纳米技术和分子生物物理学的自然延伸和必然趋势。它包括原子力显微镜（AFM）、玻璃微针、光镊和磁镊、单分子荧光光谱技术等。包含两个基本要素：测力或施力装置、生物分子的定位装置操作方式有两种：接触式，（如使用玻璃微针或AFM针尖），通过与连在 DNA 上的小球机械接触（或直接与生物分子接触）来操纵分子；非接触式（如通过光场或磁场控制小球间接的操作

2、生物分子），非接触式操纵方式测力范围较接触式小，但精度高，应用范围较广泛。单分子操作技术特点 与经典的分子生物学技术相比，单分子操作技术避免了从大量实验结果中取平均的需要，因而可以提供更为详细的生物信息。是在单分子上进行的高效、直接、简便的操作单分子操作技术原理原子力显微镜技术其目的是为了使非导体也可以采用扫描探针显微镜(SPM)进行观测，其通过探针与被测样品之间的微弱的相互作用力来获得物质表面的形貌。光镊技术利用激光动量转移产生的辐射压力，从而形成具有梯度力场的光学陷阱，处在陷阱中的微粒受到梯度力场的作用，就被“钳住”。可用于测量生物大分子间微弱的力以及生物大分子的很小位移。磁镊技术是把生物

3、分子的一端连接在载玻片上，另一端连上一个超顺磁性小球，外加一磁场吸引磁性小球，改变外磁场就可以拉伸或转动顺磁小球，从而拉伸或扭转生物分子，小球在其平衡位置附近做布朗运动其位置由光学显微镜记录 玻璃微针利用商业拉针仪器可以拉出比原子力显微镜微悬臂的弹性系数更小的微针尖，将针尖进行修饰连接上生物分子（一般是DNA）的一端，另一端连在一个可移动的精密样品台上，样品台拉伸DNA并使针尖偏转，偏转量可以用来计算力 单分子光谱技术是将荧光基团标记在生物大分子上，标记在生物大分子上的荧光基团发生各种特性变化，通过光谱分析等就能够得到有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度以及在化学

4、和静电环境下活性改变的信息。单分子操作技术的研究应用核酸与蛋白质 DNA拉伸与扭曲 DNA凝聚 核酸解链与从新折叠 单分子酶学DNA拉伸核酸单分子操作研究起始于1992 年Smith 等对单个DNA 分子的弹性测量。一段双链DNA 分子的一端连接到玻璃表面上,另一端连接到磁性小球上，DNA 分子连接到不同固体表面是通过生物素-链霉抗生物素蛋白、地高辛免疫的特异反应来实现的；整个体系的组装在溶液中完成,在外加磁力的作用下,DNA 被拉伸,借助于显微镜,就能测量到小球的位移。可以得到在不同盐浓度缓冲液中的单个 DNA 多聚体(48502 个碱基对)的力-延伸曲线,并且在这个实验中力最大只增加到10

5、 皮牛顿。当大于60pN外加作用力作用于DNA上时，一个意想不到的现象出现了：双链DNA分子发生了70的过度延伸。这种现象的出现是由于DNA发生了结构上的转变，转到了一个称之为sDNA的时相。在Cluzel等的实验中利用一根光纤作为力传感器，DNA分子一端连接在光纤上，另外一端连接在小球上，小球通过吸力作用被固定在一个微吸液管上。移动微吸液管，DNA分子就被拉伸，光 纤因此发生偏移，通过一个位置敏感的光敏二极管检测传送的激光束信号来记录光纤偏移的位置。DNA拉伸 在Smith等的实验中，两个小球分别连接到DNA分子的两端，一个小球由微吸液管控制，另外一个小球由光镊子控制。光镊子不仅能“钳住”小

6、球，也能作为力传感器，因而能够测量作用力的大小。移动微吸液管，两小球之间的距离变大，DNA分子被拉伸，因此得到力延伸曲线。DNA拉伸原理：双链DNA分子的弹性对分子的螺旋很敏感。利用一个能在连接点处阻止旋转的分子基团(如引人多个生物素和digoxygenin基团)，旋转DNA分子，DNA分子扭曲，因而能对DNA分子的弹性与扭曲张力之间的关系进行详细的研究。在这类实验中，一般使用在连接点处连接磁性小球，然后用旋转磁铁诱导旋转。DNA扭曲相应的分子构造包括三处不同的连接位点(分别用生物素、digoxygenin 和荧光素修饰)和一个起旋转作用的单链缺口；一个转子小球连接到DNA 分子中央生物素标记

7、处；转子小球由流动力(fluid flow)固定在一个地方,当旋转吸液管时,扭转的张力就在DNA 上面部分积聚；撤去流动力,转子小球转动,释放出扭曲张力。转子小球的角速度跟扭矩成正比。能够测量双链DNA分子的扭转系数；能测量酶对DNA 作用产生的扭矩。DNA凝聚DNA凝聚对于亲代细胞准确分裂成两个子代细胞来说是必须的，因为压缩状态的DNA比处于展状态的DNA更容易分裂。不同外界因素也能够诱导DNA凝聚，如多胺(精胺和亚精胺)、三价(或高价)金属离子、生物大分子荧光染料探针(如吖啶橙)、阳离子聚合物(如聚乙烯乙二醇、PEG)引等。这几种因素能够单独或联合作用诱导DNA凝聚。DNA分子与这些因素作

8、用并迅速降温，从而发生凝聚，从B型结构转变到A型结构，凝集成不同形状。Case等人应用单分子操作技术对DNA凝聚进行了研究。他们研究了原核生物Escherichiaoli沉集素(condensin)蛋白(MukBEF)对DNA的凝聚作用。Strick等后来对真核生物Xenopus laevs沉集素I(condensin I)进行单分子研究。DNA凝聚一段DNA 一端通过生物素链霉抗生物素蛋白连接到小球上，小球由光镊子控制。DNA 分子在含有MukBEF和ATP的缓冲液中温浴。另外一端通过digoxygen inant idigoxygenin反应特异地连接到另一个小球上，小球由微吸液管控制。以

9、恒定速度移动微吸液管,就得到了力-延伸曲线实验结果表明力-延伸曲线的增长比裸DNA 提前了,并且当力增加到17pN 时,在曲线上出现了一个锯齿样的图形。当同一个DNA 被多次拉伸时,能重复观测到锯齿样的图形。最令人惊奇的是DNA 凝聚能在ATP 非水解类似物存在的情况下发生,说明并非是ATP水解提供DNA 凝聚的能源,而是核苷结合提供能源。核酸解链与从新折叠 在核酸解链与重新折叠的实验中,依赖碱基顺序的力信号开始是通过玻璃微针来测量的，后来是用光镊子、原子力和磁性小球。依赖碱基顺序的力信号在近来关于 RNA 打开的实验中也观测到了。核酸解链与从新折叠 相比之前的采用最佳的分子固定连接法和光镊技

10、术，使DNA 硬度增加的同时，碱基对的敏感性也明显增加，并且在力-移动曲线中能够测量10个碱基对范围内的序列特征。另外，解螺旋力在碱基顺序不同的位置表现出特征性的跳跃，这些数值的跳跃直接反应出不同状态之间的转变。单分子酶学酶结合到双链 DNA 上可以短暂地阻止DNA 双链开口叉移动。一旦开口叉移动到结合蛋白的位置，力将会增加直到积聚到足够的弹性能量移去蛋白；因此，蛋白诱导的序列依赖的力信号峰的出现就给出了酶结合到DNA 上的位置,而峰值就提供了蛋白质-DNA 复合物稳定性的相关信息。Bockelmann 等研究了DNA 和EcoRV 限制性内切酶之间的相互作用；Koch 等不仅测量蛋白诱导的力

11、信号峰随不同速度的变，而且还比较不同蛋白质DNA 复合物的稳定性单分子酶学Charvin 等用Drosophila melanog aster 拓扑异构酶和 E.coli 拓扑异构酶作用于DNA 分子,双链DNA 分子解开了连锁状态，应用单分子操作技术能够及时地跟踪这个过程。发现Drosophila melanog aster 拓扑异构酶能以相同的速率松弛左手螺旋和右手螺旋,而 E.coli 拓扑异构酶则明显偏向于松弛左手螺旋。但是,当DNA 形成左手同向螺旋时,E.coli 拓扑异构酶也能有效地解开右手螺旋。这对于理解在复制过程中DNA 双链解连锁很有帮助。Perkins等对-核酸外切酶消化

12、单个DNA 分子进行了研究；附着在固体表面的酶与DNA 分子相连接，DNA 分子的另外一端连接到聚苯乙烯小球上；酶与小球之间维持一个恒定的作用力,它们之间的距离通过光镊子来测量。消化以近乎恒定的速率(12 核苷酸/秒)进行，在消化过程中可以观测到不同持续时间的停顿,长停顿是链和序列特异性的haevi tz 等对 E.coli 聚合酶停顿的序列依赖性及其“校正”机制进行了研究，最近,转录过程的单分子研究转移到了T7RNA 聚合酶上,这是一个用于在体外合成RNA 的单亚基酶。蛋白质的AFM研究 蛋白单分子外形的 AFM研究：旋转分子马达 、质子泵和离子泵、光合作用相关蛋白、蛋白分子伴侣 蛋白的结构

13、细节的 AFM研究：抗体标记或酶消化的鉴定、多肽环置换或移除的鉴定、多肽末端移除的鉴定 蛋白表面物理特性的 AFM 研究：蛋白表面的粘弹性、蛋白静电特性的测量、蛋白功能特性的 AFM 研究：细菌蛋白构象变化的研究、蛋白分子伴侣的工作周期研究存在的问题与解决途径蛋白单分子的可控性成像与操纵为研究驱动生物过程中的许多分子间相互作用引入了很多可能。但到目前为止,利用 AFM研究的蛋白种类还很少,能检测到的蛋白性质的参数数量也是十分有限,因而当前亟需进行的工作是进一步扩展 AFM 在蛋白研究中的应用范围,增强仪器应用的功能性。由于 AFM 在机械设计上的限制,单分子高分辨拓扑结构的记录时间比大多数生物

14、过程发生的时间相比长得多,提高扫描速度是对扫描器的设计工艺乃至材料科学的发展提出了巨大的挑战。现有 AFM 探针设计的设计具有明显的物理局限性,由于 AFM 分辨率和功能与探针性能的密切相关性,因而探针的脂膏工艺的提高也是亟待解决的关键问题解决途径 受材料和制造工艺的水平的限制,将突破点更多地寄托于引入新的设计思想和测量理念,多种高新仪器与技术的联用可能是解决该问题最有希望的方案之一。单分子荧光共振能量转移技术能够在 2 8 nm范围内测量相对位置的改变,这一能力可能与AFM成像技术联用起来以产生新的定量数据,因而单分子机制可能同时用 AFM 成像和荧光检测来表征。激光光镊技术和近场扫描光学显微镜也可与 AFM 联用来观测单分子。这些联合途径允许单分子间的相互作用和功能变换能在不同环境下进行表征。随着 AFM 探测概念的引入,能够检测样品表面多参数的仪器也得到了迅速发展,已形成了扫描探针显微镜家族。谢 谢！