Western-Blot详解及问题分析解析课件.ppt
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1、 Western Blot Western BlotWestern Blot 简介:p印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。p1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法,称为Southern印迹法。p而后人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。Western Blotl首先利用首先利用S
2、DS-PAGESDS-PAGE对蛋白质样品进行分离,然后转移到对蛋白质样品进行分离,然后转移到固相载体(例如固相载体(例如NCNC膜)上,固相载体以非共价键形式吸附膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不性不变。变。l转移后的转移后的NCNC膜就称为一个膜就称为一个印迹(印迹(blotblot),用于对蛋白质的用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液(如进一步检测。印迹首先用蛋白溶液(如5%5%的的BSABSA或脱脂奶粉或脱脂奶粉溶液)处理以封闭溶液)处理以封闭NCNC膜上剩余的疏水结合位点,而后用所
3、膜上剩余的疏水结合位点,而后用所要研究的蛋白质的要研究的蛋白质的抗体(一抗)抗体(一抗)处理,印迹中只有待研究处理,印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物,而其它的的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物,而其它的蛋白质不能与一抗结合,这样清洗除去未结合的一抗后,蛋白质不能与一抗结合,这样清洗除去未结合的一抗后,印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。Western Blotp直接法:Western Blotp间接法:优点:1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大,灵敏度高(多个二抗结合位点)3.多种标记的二抗可供选择 4.可选
4、择不同的Marker缺点:1.有交叉反应引起的非特异性条带 2.额外的二抗孵育以及条件优化 Western Blot处理过的印迹进一步用适当标记的处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理,二抗处理,二抗二抗是指一抗的抗体,是指一抗的抗体,如一抗是从鼠中获得的,则二抗就如一抗是从鼠中获得的,则二抗就是抗鼠是抗鼠IgGIgG的抗体。处理后,带有的抗体。处理后,带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置,即是待合物可以指示一抗的位置,即是待研究的蛋白质的位置。研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗特定目前有结合各种标记物的抗特定IgGIgG的抗体可以直
5、接购买作的抗体可以直接购买作为二抗,最常用的一种是酶连的二抗,印迹用酶连二抗处为二抗,最常用的一种是酶连的二抗,印迹用酶连二抗处理后,再用适当的底物溶液处理,当酶催化底物生成有颜理后,再用适当的底物溶液处理,当酶催化底物生成有颜色的产物时,就会产生可见的区带,指示所要研究的蛋白色的产物时,就会产生可见的区带,指示所要研究的蛋白质位置。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。质位置。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。Western Blot直接法直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足,标记与用二抗的间接法相比有诸多不足,标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗,避免了标二抗可用于很多种不同特异性的一抗,
6、避免了标记很多一抗的需要,同时因为一抗结合不止一个记很多一抗的需要,同时因为一抗结合不止一个二抗分子,所以二抗可以增强信号。所以一般情二抗分子,所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用况下都釆用间接法间接法进行检测。进行检测。Western Blot结合了凝胶电泳的高分辨率和固结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点相免疫测定的特异敏感等多种优点p 高分辨率的电泳技术高分辨率的电泳技术p 特异敏感的抗原特异敏感的抗原-抗体反应抗体反应p 1-5ng 1-5ng(最低可到(最低可到1010100pg100pg)中等大)中等大小的靶蛋白小的靶蛋白 Western Blotq目的
7、蛋白的表达特性分析q目的蛋白与其它蛋白的互作q目的蛋白的组织定位q目的蛋白的表达量分析被广泛地应用于蛋白质研究,基础医被广泛地应用于蛋白质研究,基础医学和临床医学的研究。学和临床医学的研究。Western Blotl蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDS-PAGESDS-PAGE转膜转膜封闭封闭一抗杂交一抗杂交二抗杂交二抗杂交底物显色底物显色 Western Blot Western Blot Western Blot1.SDS1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMEDM过硫酸铵MTris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成分凝
8、胶成分 Western Blot1.1 PAGE1.1 PAGE:聚丙烯酰胺凝胶:聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidepolyacrylamide gel)gel)是由单体丙烯酰是由单体丙烯酰胺胺(acrylamideacrylamide,简称,简称AcrAcr)和交联剂和交联剂(crosslinkercrosslinker)N,NN,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺(N,N(N,N-methylenebisacylamidemethylenebisacylamide,简称简称BisBis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网在催化剂和加速剂作用
9、下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强,具有一定的机械强度和透明状结构的凝胶。化学惰性强,具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。度。是良好的电泳介质。Western Blot聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式:聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式:单体:丙烯酰胺(单体:丙烯酰胺(AcrAcr););交联剂:甲叉双丙烯酰胺(交联剂:甲叉双丙烯酰胺(BisBis););催化剂:过硫酸胺或核黄素(催化剂:过硫酸胺或核黄素(APAP););加速剂:四甲基乙二胺(加速剂:四甲基乙二胺(TEMEDTEMED););产物:三维网状结构凝胶产物:三维网状结构凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基聚丙烯酰胺凝胶
10、聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)(free radicals)的催化,使体系发生氧化还原作用的催化,使体系发生氧化还原作用(catalyst-(catalyst-redoxredox systems)systems)来来完成的。催化体系主要有化学催化(完成的。催化体系主要有化学催化(APAPTEMEDTEMED)和光化学催化)和光化学催化(核黄素(核黄素TMTEDTMTED)体系。)体系。n影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素:试剂的纯度;温度;氧气;影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素:试剂的纯度;温度;氧气;APAP、TEMEDTEMED原则:尽量少的催化剂并在最佳时间内聚合原则:
11、尽量少的催化剂并在最佳时间内聚合。Western Blotp2SDS-PAGE上样缓冲液:上样缓冲液:pDTT可临用前以可临用前以1:4比例混合加入,亦可全部配好分装,比例混合加入,亦可全部配好分装,-20冻存。冻存。p按按1:1比例与蛋白质样品混合,比例与蛋白质样品混合,95100加热加热515min,冰上冷却后,冰上冷却后再上样,再上样,使蛋白充分变性,使蛋白充分变性,保证蛋白质从空间结构变为一级结构。保证蛋白质从空间结构变为一级结构。p电泳样品已准备就绪,可立即使用也可以分装冻存,电泳样品已准备就绪,可立即使用也可以分装冻存,-20存放的样品存放的样品可稳定保持数月。可稳定保持数月。1M
12、 Tris-HCl(pH6.8)10 ml1M DTT20 mlSDS4 g甘油甘油20 ml溴酚蓝溴酚蓝0.2 g总体积总体积100ml 100mM Tris-HCl(pH6.8)200mM DTT 4%SDS 0.2%溴酚兰溴酚兰 20%甘油甘油 ddH2O Western BlotSDS-PAGESDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入是在蛋白质样品中加入SDSSDS和含有巯基乙醇的和含有巯基乙醇的样品处理液,样品处理液,是一种很强的是一种很强的,它可,它可以以,破坏蛋白质分子的二级,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。和三级结构。强还原剂巯基乙醇(或二硫苏糖醇,强还原剂巯基乙醇(或二硫苏糖醇
13、,DTTDTT)可以可以断开二硫断开二硫键破坏蛋白质的四级结构键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与形成单链分子。解聚后的侧链与SDSSDS充分结合形成带负电充分结合形成带负电荷的蛋白质荷的蛋白质-SDS-SDS复合物。复合物。蛋白质分子结合蛋白质分子结合SDSSDS阴离子后,所带负电荷的量远远超阴离子后,所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷,从而消除了不同种蛋白质之间所过了它原有的净电荷,从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子
14、质量,而与其所带电荷的性质无关的相对分子质量,而与其所带电荷的性质无关。Western BlotSDS:p阴离子去污剂阴离子去污剂 变性剂变性剂p氨基酸侧链与氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。胶束。p蛋白质蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,消除了不量,消除了不 同分子之间原有的电荷差异。同分子之间原有的电荷差异。p与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开,使蛋白质分子线与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开,使蛋白质分子线性化。性化。Western Blot蛋白质
15、蛋白质-SDS-SDS胶束的特点:胶束的特点:(1 1)具有相同的形状,形状)具有相同的形状,形状像一个长椭圆棒像一个长椭圆棒(2 2)平均)平均1g 1g 蛋白质结合蛋白质结合1.4g SDS1.4g SDS(3 3)短轴对不同的蛋白质亚)短轴对不同的蛋白质亚基基-SDS-SDS胶束基本上是相同的胶束基本上是相同的(4 4)长轴的长度则与亚基分)长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比子量的大小成正比 Western Blotq不连续的电泳缓冲体系。qSDS蛋白质复合物在凝胶电泳时,不再受蛋白质电荷与形状的影响,而只取决于蛋白质分子量的大小。SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 We
16、stern Blot1.3 1.3 不连续电泳:不连续电泳:作用作用缓冲液缓冲液PHPH凝胶浓度凝胶浓度浓缩胶浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-Cl低,2-5%分离胶分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高,根据蛋白大小电泳缓冲液:电泳缓冲液:pH8.3 pH8.3 TrisTris-甘氨酸系统甘氨酸系统。Western Blot凝胶浓度()线性分离范围(KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE浓缩胶浓缩胶(5%Acrylamide)及分离胶配方及分离胶配方表:表:http:/ Western Blot1.5 SDS-PAGE凝胶配制凝胶
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