PCR核酸扩增仪-2解析课件.ppt
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- PCR 核酸 扩增 解析 课件
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1、 第十三章第十三章 PCRPCR基因扩增仪器基因扩增仪器(polymerase chain reaction Gene Amplifier)1内容提要内容提要1.PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理 PCR技术的原理及发展技术的原理及发展 PCR基因扩增仪的工作原理基因扩增仪的工作原理 2.PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构 定性定性PCR扩增仪扩增仪实时荧光定量实时荧光定量PCR扩增仪扩增仪 3.PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除排除 PCR扩增仪的性能指标扩增仪的性能指标PCR扩增仪的操作规程扩增仪的操作规程PCR扩增仪
2、常见故障的排除扩增仪常见故障的排除 4.PCR扩增仪的应用扩增仪的应用2第一节第一节 PCR基因扩增仪工作原理基因扩增仪工作原理 一、一、PCR技术的历史发展及原理技术的历史发展及原理 v聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一是一种种体外体外DNA扩增扩增技术。在它发明以前,对于检测对象浓技术。在它发明以前,对于检测对象浓度非常低的标本,人们没有办法用常规方法测定。度非常低的标本,人们没有办法用常规方法测定。1971年,年,Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述等人首次在文章中准确、客观地阐述了了PCR方法。方法。1985年,美国年,美
3、国PE-Cetus公司的公司的Kary Mullis等人发明等人发明PCR技术。技术。它推动了现代医学由细胞水它推动了现代医学由细胞水平向分子水平、基因水平发展,是平向分子水平、基因水平发展,是DNA测序的基础,它测序的基础,它成为现代分子生物学发展过程中的一座里程碑。成为现代分子生物学发展过程中的一座里程碑。3PCR技术是在试管中技术是在试管中(体外)给(体外)给DNA的合的合成提供一种合适条件成提供一种合适条件-模板模板DNA、dNTP、寡核苷酸引物、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲聚合酶、合适的缓冲体系,及让体系,及让DNA变性、变性、复性及延伸的温度和复性及延伸的温度和时间,使时
4、间,使DNA能够体能够体外复制。外复制。Mullis等因等因此项技术获得此项技术获得1993年年诺贝尔奖。诺贝尔奖。4vPCR原理及其步骤原理及其步骤:加热使双链:加热使双链DNA解开解开螺旋,在退火温度条件下加入的引物同模螺旋,在退火温度条件下加入的引物同模板板DNA杂交,在杂交,在Taq DNA聚合酶、聚合酶、dNTPs、Mg2+和合适和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物,缓冲液存在条件下延伸引物,重复重复“变性变性退火退火引物延伸引物延伸”过程至过程至25-40个循环,待测样本中的核酸拷贝数呈指个循环,待测样本中的核酸拷贝数呈指数级扩大。数级扩大。5其过程其过程1:加热变性:加热变性 加热
5、(通常加热(通常93左右)可将双链左右)可将双链DNA分为两条分为两条单链,称之为单链,称之为“变性变性”。因为连接碱基之间的氢键较弱,它们在高温下因为连接碱基之间的氢键较弱,它们在高温下断裂,而脱氧核糖和磷酸之间的共价键结合力较强,断裂,而脱氧核糖和磷酸之间的共价键结合力较强,在高温下保持不变。在高温下保持不变。6过程过程2 退火,引物与靶序列结合退火,引物与靶序列结合v引物是短的、人工合成的单链引物是短的、人工合成的单链DNA序列,有序列,有20-30个碱基,具有标记的个碱基,具有标记的5端,便于下一步检测。它们端,便于下一步检测。它们对于待扩增的靶核酸是特异的。对于待扩增的靶核酸是特异的
6、。PCR反应需有两条反应需有两条引物,每一条都与变性过程中产生的引物,每一条都与变性过程中产生的DNA单链互补。单链互补。v退火温度:通常在退火温度:通常在40-65进行,视引物的长度和进行,视引物的长度和碱基序列而定。这样保证了引物与靶序列退火结合碱基序列而定。这样保证了引物与靶序列退火结合的高度特异性。的高度特异性。注意:注意:PCR反应并不是复制整个反应并不是复制整个DNA链,而是复制链,而是复制某一段生物体特异的某一段生物体特异的100-600个碱基对的靶序列。个碱基对的靶序列。78过程过程3:延伸:延伸v一旦引物与互补一旦引物与互补DNA序列退火,温度即提高至近序列退火,温度即提高至
7、近72,Taq DNA聚合酶被用于复制聚合酶被用于复制DNA链。链。Taq DNA聚合酶是一种来源于嗜热水生菌(聚合酶是一种来源于嗜热水生菌(Thermus aquaticus)的重组的热稳定的)的重组的热稳定的DNA聚合酶,与一聚合酶,与一般聚合酶不同的是在高温状态仍具有活性。般聚合酶不同的是在高温状态仍具有活性。Taq DNA聚合酶在引物标记的地方开始合成。它使溶液聚合酶在引物标记的地方开始合成。它使溶液中自由的互补核苷酸(中自由的互补核苷酸(dNTPs)的掺入和结合,合)的掺入和结合,合成与目标成与目标DNA区域原始双链一样的新的双链区域原始双链一样的新的双链DNA分分子。子。延伸通常起
8、始于引物的延伸通常起始于引物的3端,从而使得单链变端,从而使得单链变为双链。为双链。Taq DNA聚合酶特定地从聚合酶特定地从5端到端到3端合成。端合成。因此,溶液中的自由的核苷酸仅加于引物的因此,溶液中的自由的核苷酸仅加于引物的3端,端,形成靶形成靶DNA序列的互补链。序列的互补链。91030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量-(10亿)亿)11二、二、PCR核酸扩增仪工作原理与控温方式核酸扩增仪工作原理与控温方式v在在PCR反应中需以变性、退火、延伸三种温度为一反应中需以变性、退火、延伸三种温度为一个循环,因此,设计个循环,因此,设计PCR基因扩增仪就要能精确控基因扩增仪就要
9、能精确控制温度,这对制温度,这对PCR反应十分关键。反应十分关键。vTaq DNA聚合酶的应用大大提高了聚合酶的应用大大提高了PCR的效率,无的效率,无需在需在PCR反应过程中反复加入新鲜酶。反应过程中反复加入新鲜酶。Taq DNA聚聚合酶酶促反应最适温度为合酶酶促反应最适温度为7075。v最早的最早的PCR是是利用大肠杆菌利用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I I的的Klenow片段进行核酸扩增。问题是该酶不耐热,当样品置片段进行核酸扩增。问题是该酶不耐热,当样品置于高温于高温(9495)条件下时不可逆失活,故在退火条件下时不可逆失活,故在退火及延伸时,需再向反应液中加入新鲜酶以供扩增所及延伸时,
10、需再向反应液中加入新鲜酶以供扩增所需,相当繁琐。需,相当繁琐。12PCRPCR仪温度控制仪温度控制,有,有:水浴锅控温水浴锅控温 压缩机控温压缩机控温 半导体控温半导体控温 离心式空气加热控温离心式空气加热控温 PCR温度控制重要性:温度控制重要性:从从PCR反应基本原理可知,反应基本原理可知,基因扩增仪工作关键是温度基因扩增仪工作关键是温度控制控制。13水浴锅控温水浴锅控温v以不同温度的以不同温度的水浴锅水浴锅串联成一个控温体系。串联成一个控温体系。v样品与水直接无缝接触,控温准确,温度均样品与水直接无缝接触,控温准确,温度均一性好,无边缘效应。一性好,无边缘效应。v体积大,自动化程度不高,
11、需人为干预,更体积大,自动化程度不高,需人为干预,更换水浴锅时控温不稳定。换水浴锅时控温不稳定。14压缩机控温压缩机控温v由由压缩机压缩机自动控温,金属导热,控温较水浴锅方便,自动控温,金属导热,控温较水浴锅方便,一台机器便可完成整个一台机器便可完成整个PCR流程。但流程。但 压缩机故障率压缩机故障率高,边缘效应及温度高,边缘效应及温度overshooting现象严重。现象严重。vovershooting:升温过程中,由于一些加热元件,升温过程中,由于一些加热元件,比如半导体、金属块比如半导体、金属块本身会积蓄能量本身会积蓄能量,虽然温度探,虽然温度探头探测温度到达了设定温度,但这些积蓄的能量
12、仍头探测温度到达了设定温度,但这些积蓄的能量仍然会传给然会传给PCR体系,造成体系,造成实际的温度高于设定的温实际的温度高于设定的温度的现象度的现象。15半导体控温半导体控温v由由半导体半导体自动控温,金属导热,控温方便,自动控温,金属导热,控温方便,体积小,相对稳定性好。体积小,相对稳定性好。v缺点:仍缺点:仍有边缘效应有边缘效应,温度均一性尚有欠缺,温度均一性尚有欠缺,各孔扩增效率可能不一致,也存在温度各孔扩增效率可能不一致,也存在温度overshooting现象。现象。16离心式空气加热控温离心式空气加热控温v由金属由金属线圈加热线圈加热,采用,采用空气空气作为导热媒介,作为导热媒介,温
13、度均一性好,各孔扩增效率高度一致温度均一性好,各孔扩增效率高度一致v满足荧光定量满足荧光定量PCR的高要求,直接发展为离的高要求,直接发展为离心式的定量心式的定量PCR仪。仪。17第二节第二节 PCR扩增仪的分类与结构扩增仪的分类与结构一、一、PCRPCR扩增仪的种类扩增仪的种类 普通普通PCRPCR扩增仪扩增仪 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR扩增仪扩增仪 梯度梯度PCRPCR仪仪 原位原位PCRPCR仪仪 18一、一、普通定性普通定性PCR扩增仪扩增仪v特点特点 变温快、时间准、温度均一,目变温快、时间准、温度均一,目前国内仍有应用。仪器一般由三个不同前国内仍有应用。仪器一般由三个不同
14、温度的水浴槽和机械臂组成,采用半导温度的水浴槽和机械臂组成,采用半导体传感技术、电子技术和计算机技术进体传感技术、电子技术和计算机技术进行水浴温度的测量、显示和控制,并经行水浴温度的测量、显示和控制,并经计算机控制由机械臂完成样品在每个水计算机控制由机械臂完成样品在每个水浴槽的置放以及槽间的移动。浴槽的置放以及槽间的移动。19v1水浴式水浴式PCR仪仪 一般由三个不同温度的水浴槽一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成,采用半导体传感技术、电子技术和机械臂组成,采用半导体传感技术、电子技术和计算机技术进行水浴温度的测量、显示和控制,和计算机技术进行水浴温度的测量、显示和控制,并经计算机控制由机械
15、臂完成样品在每个水浴槽并经计算机控制由机械臂完成样品在每个水浴槽的置放以及槽间的移动。此类的置放以及槽间的移动。此类PCR仪体积较大,仪体积较大,但变温快、时间准、温度均一,目前国内应用较但变温快、时间准、温度均一,目前国内应用较少。少。v2 2、变温金属块式、变温金属块式PCRPCR仪仪:中心是由铝块或不锈钢:中心是由铝块或不锈钢制成的热槽,上有不同数目甚至不同规格的凹孔,制成的热槽,上有不同数目甚至不同规格的凹孔,用来放置样品管。一般用来放置样品管。一般通过半导体加热和冷却,通过半导体加热和冷却,并由微机控制恒温和冷热处理过程并由微机控制恒温和冷热处理过程。装置比较牢。装置比较牢固耐用,温
16、度变换平稳,有利于保持固耐用,温度变换平稳,有利于保持Taq DNATaq DNA聚合聚合酶的活性。酶的活性。20v3、变温气流式、变温气流式PCR仪仪 这类仪器由机壳、热源、这类仪器由机壳、热源、冷空气泵、控制器及辅助元件等组成。热源由电阻冷空气泵、控制器及辅助元件等组成。热源由电阻元件和吹风机组成,形成热空气枪借空气作为热传元件和吹风机组成,形成热空气枪借空气作为热传播媒介,由大功率风扇及制冷设备提供外部冷空气播媒介,由大功率风扇及制冷设备提供外部冷空气制冷,精确的温度传感器构成不同的温度循环。该制冷,精确的温度传感器构成不同的温度循环。该仪器不用金属精密加工,成本较低;整个系统没有仪器不
17、用金属精密加工,成本较低;整个系统没有液体流动及制冷剂,安全程度高。液体流动及制冷剂,安全程度高。PCR仪配上微机仪配上微机和软件,可灵活编程。和软件,可灵活编程。21v4梯度梯度PCR仪仪 由普通由普通PCR仪衍生出的具温度梯仪衍生出的具温度梯度功能的度功能的PCR核酸扩增仪。使用梯度核酸扩增仪。使用梯度PCR仪,多仪,多种变性温度和延伸温度可在一台扩增仪上同时完种变性温度和延伸温度可在一台扩增仪上同时完成,既节省实验时间、提高实验效率,又节约实成,既节省实验时间、提高实验效率,又节约实验成本。验成本。PCR反应能否成功,退火温度是关键,反应能否成功,退火温度是关键,虽然有各种各样的虽然有各
18、种各样的PCR引物设计软件或者经验公引物设计软件或者经验公式计算最合适的退火温度,可是模板中碱基的组式计算最合适的退火温度,可是模板中碱基的组合千变万化,经验公式得到的数据不一定都合适。合千变万化,经验公式得到的数据不一定都合适。梯度梯度PCR仪每个孔的温度可以在指定范围内按照仪每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置,根据扩增结果,一步就可以摸索出最梯度设置,根据扩增结果,一步就可以摸索出最适反应条件。适反应条件。22v5原位原位PCR仪仪 即即在细胞内进行在细胞内进行PCR扩增扩增,而,而组织细胞的形态不被破坏,它是原位杂交与组织细胞的形态不被破坏,它是原位杂交与PCR技术的结合。以往手工
19、方法操作复杂,扩增效果技术的结合。以往手工方法操作复杂,扩增效果及实验结果重复性均不理想。原位及实验结果重复性均不理想。原位PCR仪以其创仪以其创新的设计,比较好地解决了这些问题。新的设计,比较好地解决了这些问题。v原位原位PCR仪与普通仪与普通PCR仪的区别在于,其样品基仪的区别在于,其样品基座上有若干平行的铝槽,每条铝槽内可垂直放置座上有若干平行的铝槽,每条铝槽内可垂直放置一张载玻片,每张载玻片面均与铝槽紧密接触,一张载玻片,每张载玻片面均与铝槽紧密接触,温度传导极佳,控温很精确。目前也有在普通温度传导极佳,控温很精确。目前也有在普通PCR仪上增加原位仪上增加原位PCR模块的,就可以进行原
20、位模块的,就可以进行原位PCR扩增。不少厂家的扩增。不少厂家的PCR仪都可以提供原位适仪都可以提供原位适配器,配有支持原位配器,配有支持原位PCR模块的模块的PCR仪可以一机仪可以一机两用,比较经济。两用,比较经济。23(二)(二)实时荧光定量实时荧光定量PCR扩增仪扩增仪v荧光实时定量荧光实时定量PCR技术技术(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)是在是在PCR反应体系中加入特异反应体系中加入特异性的荧光染料或探针,荧光信号的变化真实地反性的荧光染料或探针,荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加,通过检测荧光信号,从映了体系中模板的增加,通过检测荧光信号,
21、从而实时监测整个而实时监测整个PCR反应过程,最后通过标准曲反应过程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。线对未知模板进行定量分析。v定量定量PCR仪通常由两部分组成,即仪通常由两部分组成,即PCR系统和荧系统和荧光检测系统。目前的主流是多色多通道检测,通光检测系统。目前的主流是多色多通道检测,通道及适用荧光素越多,仪器的适用范围就越宽。道及适用荧光素越多,仪器的适用范围就越宽。24TaqMan实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理25261、金属板式实时定量、金属板式实时定量PCR仪仪v 即传统的即传统的9696孔板式定量孔板式定量PCRPCR仪,由第三代的半导体仪,由第三代的半导体PC
22、RPCR仪发展而来。在原有仪发展而来。在原有PCRPCR仪的基础上,增加荧光仪的基础上,增加荧光激发和检测模块,升级为荧光定量激发和检测模块,升级为荧光定量PCRPCR仪。仪。v ABI 7500ABI 7500型荧光定量型荧光定量PCRPCR仪的激发光源为卤钨仪的激发光源为卤钨灯,与灯,与5 5色滤光镜配合,可同时激发色滤光镜配合,可同时激发9696个样品;个样品;v检测器为超低温检测器为超低温CCDCCD成像系统,可同时多点多色检成像系统,可同时多点多色检测,能有效分辨测,能有效分辨FAM/SYBR GreenIFAM/SYBR GreenI、VIC/JOEVIC/JOE、NED/TAMR
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