黄国宁-实验室环境与生殖风险课件.ppt

1、实验室环境与生殖风险实验室环境与生殖风险 黄国宁黄国宁重庆市妇幼保健院重庆市妇幼保健院2014-04-12Emma Lucas，Reproductive BioMedicine Online,(2013)Laboratory 体外培养技术已趋成熟，体外培养环境仍无法完体外培养技术已趋成熟，体外培养环境仍无法完全模拟输卵管及子宫内条件全模拟输卵管及子宫内条件;暴露于体外的配子暴露于体外的配子/胚胎时刻受到实验室环境潜在的威胁。胚胎时刻受到实验室环境潜在的威胁。Chemical/MetabolicToxins/PollutantsMechanicalTemperaturepHLightOsmola

2、lityOxidantsARTART风险风险2022-12-5 尽管尚无充分的数据证明尽管尚无充分的数据证明ART技术显著增加生殖风险技术显著增加生殖风险，但越来越多的文献提示，但越来越多的文献提示ART生殖风险是增加的。生殖风险是增加的。2022-12-5影响影响ART风险因素风险因素 高剂量的外源性激素高剂量的外源性激素（Aimee SC,et al,FS,2005）实验室技术实验室技术 体外操作体外操作 操作技术（操作技术（JH Yan,et al,FS.2011;MJ Davies,et al.NEJM.2012）体外培养（体外培养（JC.Dumoulin,et al.HR,2010）

3、操作环境操作环境目前尚无充分数据显示实验室环境因素导致生殖风险等增目前尚无充分数据显示实验室环境因素导致生殖风险等增加，但越来越多的研究显示诸如温度、空气质量等显著影加，但越来越多的研究显示诸如温度、空气质量等显著影响胚胎的发育潜能。响胚胎的发育潜能。实验室环境实验室环境空气质量空气质量温度温度湿度湿度光照强度光照强度2022-12-5雾 霾一、空气质量一、空气质量 尘埃粒子尘埃粒子 空气中有害气体成分空气中有害气体成分影响因素：影响因素：室外大环境的空气质量室外大环境的空气质量 实验室内实验室内:选址、装修选址、装修 使用的耗材、仪器、电脑使用的耗材、仪器、电脑 清洁、洗涤剂清洁、洗涤剂 工

4、作人员工作人员 u城市气候及环境污染城市气候及环境污染 不同地区气候及环境影响不同地区气候及环境影响IVF实验室成功率实验室成功率 大气候对大气候对IVF结局是有很大影响结局是有很大影响u室外大气污染室外大气污染 悬浮颗粒物（悬浮颗粒物（PM10，PM2.5）CO、SO2、NO2、NO.臭氧、挥发性有机化合物臭氧、挥发性有机化合物(VOCs)空气中空气中PM10浓度的增加，浓度的增加，IVF早期流产增加早期流产增加Perin P,et al.J Assist Reprod Genet，2010 NO2浓度浓度出生率出生率 微细颗粒（微细颗粒（PM2.5）浓度）浓度妊娠率妊娠率 层流装置可以降低

5、室内空气尘埃粒子的数量层流装置可以降低室内空气尘埃粒子的数量 但层流不能去除但层流不能去除VOCs作者作者年份年份实验设计实验设计对象对象结果结果Little and Mirkes1990基础研究基础研究体外培养体外培养兔胚胎兔胚胎高水平丙烯醛与胚胎毒性相关高水平丙烯醛与胚胎毒性相关Mayer,et al 1999临床前瞻性研究临床前瞻性研究IVF治疗治疗不孕夫妇不孕夫妇胚胎培养于有胚胎培养于有VOC滤膜滤膜CO2培养箱培养箱可获得较高妊娠率可获得较高妊娠率Racowsky,et al1999临床观察研究临床观察研究IVF治疗治疗不孕夫妇不孕夫妇胚胎培养于有活性炭滤膜胚胎培养于有活性炭滤膜CO

6、2培养箱，培养箱，可降低自发流产率可降低自发流产率Worrilw,et al 2002临床观察研究临床观察研究IVF治疗治疗不孕夫妇不孕夫妇季节性温度湿度变化影响季节性温度湿度变化影响Lab VOC浓浓度，最终影响胚胎种植率度，最终影响胚胎种植率Esteves,et al2004临床观察研究临床观察研究IVF治疗治疗不孕夫妇不孕夫妇安装安装VOC滤膜可提高优胚率、临床妊滤膜可提高优胚率、临床妊娠率并降低自发流产率娠率并降低自发流产率 Fabiola Bento et al,Quality Management in ART Clinics,2013 VOCs影响胚胎发育潜能的研究影响胚胎发育潜

7、能的研究u体外胚胎特点体外胚胎特点无自身免疫系统无自身免疫系统 无防御无防御VOCs的入侵的生理屏障的入侵的生理屏障 -Hall J et al,1998u空气质量空气质量 胚胎的发育潜能胚胎的发育潜能 胚胎形态可能无明显异常胚胎形态可能无明显异常 -Cohen J et al,1997 VOCs 总量总量0.1/10亿时，不影响临床结局亿时，不影响临床结局 VOCs 总量总量2/10亿时，显著影响临床结局亿时，显著影响临床结局-Alex C varghese et al,A practial guide to setting up an IVF lab ,embryo culture sys

8、tems and running the unit.2013 改善改善IVF室内的空气质量，可能改善室内的空气质量，可能改善IVF治疗结局。治疗结局。2022-12-5 VOCs对对IVF的影响的影响研究使用净化器前后研究使用净化器前后IVF妊娠结局的变化妊娠结局的变化P1（Period1）：使用净化器前（未测量）：使用净化器前（未测量VOCs)P2：使用净化器后（：使用净化器后（VOCs在在00.8ppm）P3：使用改进的净化器，：使用改进的净化器，VOCs维持维持0.0ppmCottin V,et al,ESHRE，2011，P-155结果：结果：阶段阶段2(P2)空气中测出含有二甲苯和丙

9、苯成分；空气中测出含有二甲苯和丙苯成分；OPU周期：周期：组间受精率无显著性差异；组间受精率无显著性差异；P1与与P2妊娠率无差异妊娠率无差异 P3期间生化妊娠率显著高于期间生化妊娠率显著高于 P1+P2（33.8%vs 19.8%；p0.05);P3临床妊娠率显著高于临床妊娠率显著高于 P1+P2（p0.01)。FET周期三组间无差异。周期三组间无差异。结论：结论：VOCs（二甲苯、丙苯）影响新鲜周期的临床妊娠率。（二甲苯、丙苯）影响新鲜周期的临床妊娠率。Cottin V,et al,ESHRE，2011，P-155不同空气净化装置处理后不同空气净化装置处理后IVF实验室空气质量实验室空气质

10、量First sampling:活性炭滤膜更换前活性炭滤膜更换前Second sampling:活性炭滤膜更换后活性炭滤膜更换后Third sampling:活性炭滤膜活性炭滤膜+Landson 系统系统 Rabea Youcef Khoudja et al.J Assist Reprod Genet.2013TT1:活性炭滤膜更换前；活性炭滤膜更换前；TT2活性炭滤膜更换后；活性炭滤膜更换后；TT3:活性炭滤膜活性炭滤膜+Landson 系统系统 IVF实验室空气改善可以提高胚胎质量，妊娠及种植率。实验室空气改善可以提高胚胎质量，妊娠及种植率。Rabea Youcef Khoudja et

11、al.J Assist Reprod Genet.2013千级千级配子配子/胚胎操作区的空气质量胚胎操作区的空气质量(1)千级千级配子配子/胚胎操作区的空气质量胚胎操作区的空气质量(2)净化后空气中净化后空气中VOCs含量含量二氧化氮二氧化氮氨氨臭氧臭氧甲醛甲醛苯苯甲苯甲苯二甲苯二甲苯空气净化（空气净化（-）0.0300.0470.030.0250.0250.0050.1空气净化（空气净化（+）0.0170.0290.030.0170.0250.0050.1重庆市妇幼保健院，重庆市妇幼保健院，2009单位：单位：mg/m3二、温度二、温度可能影响可能影响MII卵纺锤体卵纺锤体可能影响胚胎相关基

12、因的表达可能影响胚胎相关基因的表达可能影响胚胎代谢可能影响胚胎代谢胚胎发育潜能胚胎发育潜能 IVF实验室一般情况下：每间隔实验室一般情况下：每间隔3分钟，工作分钟，工作3分钟分钟传统的温度湿度控制系统传统的温度湿度控制系统IVF实验室不同时间温度及湿度实验室不同时间温度及湿度湿度湿度温度温度 CQ-RGI 2013平均温度：平均温度：24.3；平均湿度：；平均湿度：59.2实验室温度设定实验室温度设定24 时不同位置温度和湿度时不同位置温度和湿度进风口进风口 风速和温度风速和温度距地面距地面1m 风速和温度风速和温度回风口回风口 风速和温度风速和温度 实验室温度分别设置为实验室温度分别设置为2

13、020和和2626 使用实施温度测定探针分别测定培养箱、显微镜热台表使用实施温度测定探针分别测定培养箱、显微镜热台表 面以及载玻片加热器等设备的温度面以及载玻片加热器等设备的温度 5min/5min/次，连续测量次，连续测量12h12h设备名称设备名称20202626Paired differencePaired differenceP valueP value尼康倒置显微镜尼康倒置显微镜34.3034.300.020.0236.1636.160.070.071.861.860.070.070.00010.0001尼康荧光显微镜尼康荧光显微镜3,43,435.1535.151.131.1336

14、.9036.900.210.212.052.050.170.170.00010.0001尼康体视显微镜尼康体视显微镜2,52,533.0833.080.790.7935.0235.020.360.361.751.751.321.320.00010.0001尼康尼康TE2000-STE2000-S35.0035.000.070.0737.0537.050.160.161.941.940.460.460.00010.0001载玻片加热器载玻片加热器1 134.3834.380.160.1636.3836.380.080.083.393.390.200.200.00010.0001载玻片加热器载玻片

15、加热器3 332.7432.740.360.3635.8935.890.470.473.143.140.550.550.00010.0001载玻片加热器载玻片加热器2,4,52,4,532.8232.820.290.2935.7635.760.390.392.942.940.480.480.00010.0001热块热块3 334.7034.700.930.9335.1935.190.900.900.490.491.211.210.00010.0001热块热块5 537.1237.120.080.0837.6737.670.050.050.550.550.090.090.00010.0001干燥

16、培养箱干燥培养箱2 236.7936.790.170.1737.737.70.160.160.880.880.270.270.00010.0001培养箱培养箱1 137.037.00.080.0837.037.00 00.0080.0080.090.090.320.32培养箱培养箱111136.6036.600.020.0237.037.00.0090.0090.100.100.0090.0090.00010.0001培养箱培养箱121236.436.40 036.636.60 00.200.200.00.00.00010.0001室温室温20和和2626时不同设备的温度变化时不同设备的温度变

17、化Julia M,et al,Reproduction,J Assist Reprod Genet,2013实验室温度突然变化时显微镜热台温度的恢复情况实验室温度突然变化时显微镜热台温度的恢复情况Julia M,et al,Reproduction,J Assist Reprod Genet,2013取卵时卵泡液温度与囊胚形成、活产率密切相关取卵时卵泡液温度与囊胚形成、活产率密切相关36.4(组组1)36.4-36.9(组组2)36.9(组组3)囊胚形成率囊胚形成率1408/4165（33.8%）VS.组组2：p 0.00012331/5684（41.0%）139/457（30.4%）VS.组

18、组2：p 0.0001种植率种植率482/1406（34.3%）VS.组组2：p=0.0006716/1898（40.1%）39/170（22.9%）VS.组组2：p 0.0001活产率活产率293/665（44.1%）VS.组组2：p=0.0006484/917（52.8%）29/77（37.7%）VS.组组2：p=0.015理想的卵泡液温度为理想的卵泡液温度为36.436.9，过高过低都会影响着床率及活产率。，过高过低都会影响着床率及活产率。Sherbahn.R.,et al,ARSM,2010 人的成熟卵在低温下纺锤体的形态变化人的成熟卵在低温下纺锤体的形态变化 温度温度 冷却前纺锤体冷

19、却前纺锤体 冷却后冷却后5min 冷却后冷却后10min 加热后加热后10min 加热后加热后20min 37 5/5*5/5 5/5 5/5 5/5 33 5/5 5/5 0/5 5/5 5/5 28 5/5 0/5 0/5 0/5 2/5 25 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5*同一卵子用纺锤体显示仪进行动态观察。同一卵子用纺锤体显示仪进行动态观察。第一个数为有纺锤体的卵子数，第二个数字为检查的总卵数。第一个数为有纺锤体的卵子数，第二个数字为检查的总卵数。Wang WH,et al Hum Reprod,2001,16:137433时时 10分钟后纺锤体消失；分钟后纺锤体消失；28

20、时时5分钟后纺锤体消失，且加热后分钟后纺锤体消失，且加热后10分钟纺锤体无恢复分钟纺锤体无恢复。37与室温下分别收集小鼠合子其囊胚形成和囊胚细与室温下分别收集小鼠合子其囊胚形成和囊胚细胞数不受影响（收集用时胞数不受影响（收集用时5分钟）分钟）M.Lane,et al,Reproduction,Fertility and Development,2008,20,23-32两组间两组间IGF2和和IGF2R表达存在显著差异表达存在显著差异M.Lane,et al，Reproduction,Fertility and Development，2008，20,23-32三、湿度三、湿度 渗透压对配子渗

21、透压对配子/胚胎的影响：胚胎的影响：渗透压的改变，扰乱配子渗透压的改变，扰乱配子/胚胎内离子平衡胚胎内离子平衡 影响配子影响配子/胚胎的结构和功能胚胎的结构和功能 湿度虽然不会直接影响胚胎，但在准备培养皿时湿湿度虽然不会直接影响胚胎，但在准备培养皿时湿 度可能影响微滴的渗透压度可能影响微滴的渗透压 Dawson KM,Baltz JM 1997.Biology of Reproduction 56,15501558.渗透压的改变降低鼠胚胎渗透压的改变降低鼠胚胎4-cell以上胚胎以及囊胚发以上胚胎以及囊胚发育率育率A,B：正常纺锤体：正常纺锤体渗透压改变会影响渗透压改变会影响猪卵母细胞纺锤体猪

22、卵母细胞纺锤体形态形态 S.F.Mullen,et al.Cryobiology,2007 54,281-289.分别把分别把GV和和MII期牛卵母细胞放入期牛卵母细胞放入 75、150、600、1200、2400和和4800 mOsm/kg NaCl 溶液内溶液内10min,然后进行体外成熟然后进行体外成熟或者授精或者授精 比较卵母细胞成熟以及胚胎发育比较卵母细胞成熟以及胚胎发育不同渗透压处理对牛卵母细胞成熟及多精受精率的影响不同渗透压处理对牛卵母细胞成熟及多精受精率的影响MII期处理期处理GV期处理期处理渗透压改变显著影响牛卵母细胞成熟率渗透压改变显著影响牛卵母细胞成熟率及多精受精率及多精

23、受精率不同渗透压处理对牛卵母细胞受精率及卵裂率的影响不同渗透压处理对牛卵母细胞受精率及卵裂率的影响MII期处理期处理GV期处理期处理 相对于相对于MII期，期，GV期牛卵母细胞对渗透期牛卵母细胞对渗透 压改变更敏感压改变更敏感制备微滴的环境因素影响培养基的渗透压和鼠胚的发育制备微滴的环境因素影响培养基的渗透压和鼠胚的发育 JE Swain.,et al,RBM-Onilne.2012 Std：标准准备方法：制作：标准准备方法：制作10(20 or 40)ul微滴后迅速覆盖油微滴后迅速覆盖油Wash：标准方法完成准备后，用吸管吸出培养基，从新注入新的培养基：标准方法完成准备后，用吸管吸出培养基，

24、从新注入新的培养基 JE Swain.,et al,RBMOnilne.2012JE Swain,et al,RBMOnilne.2012JE Swain,et al,RBMOnilne.2012植入前胚胎体外暴露于植入前胚胎体外暴露于400700nm波长的光就会受到非自然应激波长的光就会受到非自然应激的影响。有报道研究了的影响。有报道研究了IVF过程中光的组成和强度，并计算了到过程中光的组成和强度，并计算了到达胚胎的辐射计量。结果表明，如果不使用虑光器，常规达胚胎的辐射计量。结果表明，如果不使用虑光器，常规IVF过过程中可以导致一个应激的计量。程中可以导致一个应激的计量。五、光照强度五、光照

25、强度L.D.M.Ottosen,et al.J Assist Reprod Genet,2007L.D.M.Ottosen,et al.J Assist Reprod Genet,2007光线对胚胎的影响可能因胚胎发育时期以及物种不同而存在差异光线对胚胎的影响可能因胚胎发育时期以及物种不同而存在差异L.D.M.Ottosen,et al.J Assist Reprod Genet,2007Takenaka M,et al,Proc Natl Acad Sci 2007 光线损伤胚胎的机理（氧毒性）光线损伤胚胎的机理（氧毒性）氧离子氧离子分子氧分子氧O2（显著降低（显著降低O2）H2O2 过氧化

26、物过氧化物Fe、Cu OH0（强氧（强氧化剂、强毒性）化剂、强毒性）细胞损伤细胞损伤 Catt and Henman,2000 氧化物破坏氧化物破坏培养基中氧浓度增加培养基中氧浓度增加过氧化物歧化酶过氧化物歧化酶过氧化物酶过氧化物酶l 牛胚胎操作过程中，体视显微镜加绿色滤光片与不加滤光牛胚胎操作过程中，体视显微镜加绿色滤光片与不加滤光片虽然不影响胚胎的发育，但用无滤光片体视显微镜操作的片虽然不影响胚胎的发育，但用无滤光片体视显微镜操作的胚胎可以检测到诱导型应激蛋白的表达胚胎可以检测到诱导型应激蛋白的表达比较光照对鼠胚的影响，比较光照对鼠胚的影响，A示示 受精卵暴露于白色荧光（受精卵暴露于白色荧

27、光（1200lx）15分钟后分钟后形成的囊胚，细胞碎片增多，凋亡小体增加（形成的囊胚，细胞碎片增多，凋亡小体增加（TUNEL assay），），B示示 没有没有暴露于光照的囊胚暴露于光照的囊胚Manami Takenaka,et al,2007 尽量缩短配子、胚胎暴露显微镜下观察或操作时间尽量缩短配子、胚胎暴露显微镜下观察或操作时间 但使实验室过暗是不安全的也是没有必要的但使实验室过暗是不安全的也是没有必要的 相对于胚胎而言，光线影响的阈值不明确相对于胚胎而言，光线影响的阈值不明确 使用红色滤光片使用红色滤光片 日光灯？日光灯？白炽灯？白炽灯？小结小结 IVF实验室空气质量影响胚胎发育，降低其

28、发育潜能，通过安装实验室空气质量影响胚胎发育，降低其发育潜能，通过安装空气净化系统，可以改善空气净化系统，可以改善IVF实验室空气质量，提高胚胎质量和实验室空气质量，提高胚胎质量和妊娠结局。妊娠结局。IVF实验室温度变化影响卵子纺锤体、胚胎细胞器以及相关基因实验室温度变化影响卵子纺锤体、胚胎细胞器以及相关基因 表达，而影响其发育潜能，增加生殖风险表达，而影响其发育潜能，增加生殖风险.IVF实验室湿度可能通过影响培养液渗透压实验室湿度可能通过影响培养液渗透压,影响胚胎发育潜能。影响胚胎发育潜能。IVF实验室光照强度也会影响胚胎发育潜能，甚至改变其表观遗实验室光照强度也会影响胚胎发育潜能，甚至改变其表观遗传学，增加胎儿的安全风险。传学，增加胎儿的安全风险。实验室环境对生殖风险的影响需要进一步的研究实验室环境对生殖风险的影响需要进一步的研究。