医学精品课件：14.自身免疫病检查.ppt

1、自身抗体的实验室检查,(laboratory testingof autoantibodies),南方医院检验科(系） 裘宇容 教授 电话：61642143,自身免疫性疾病 （autoimmune disease AID）,一、定义：自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。,二、分类： 1.器官非特异性 2.器官特异性,器官非特异性 （系统性）AID 系统性红斑狼疮 干燥综合征 类风湿关节炎 系统性血管炎 抗磷脂综合征 系统性硬化病 多发性肌炎和皮肌炎 混合性结缔组织病,器官特异性AID,rheumatic diseases,自身免疫性疾病 （autoimm

2、une disease AID）,一、定义：是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。,三、特征：,1 . 5D特点,二、分类,痛苦（discomfort） 残废（disability） 死亡（death） 药物中毒（drug toxity） 经济损失（dollar lost）,2. 血中可检测出高滴度的自身抗体,自身抗体:是指抗自身组织器官、细胞内、 细胞表面和细胞外成分(自身抗原）的免 疫球蛋白 .,自身抗体（autoantibodies）,一些自身免疫性风湿病伴有特征性的 自身抗体(谱),系统性红斑狼疮（SLE）,SLE中存在的自身抗体达百种以上,类风湿关节炎,干燥综

3、合征（SS）,自身抗体实验室检测,一、 ANA定义： 传统定义：针对细胞核成分自身抗体的总称. 广义定义：抗核抗体的靶抗原已不再局限于细胞 核内，而是扩展到整个细胞，是针对细胞内所有抗原 成分的总称。,抗核抗体( ANA),细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期蛋白等,ANA的靶抗原分布,细胞核,整个细胞,二、抗核抗体的分类(1),1. 抗DNA抗体,抗双链DNA (dsDNA) 抗体 抗单链DNA (ssDNA) 抗体,2. 抗组蛋白抗体：histons H1,H2A,H2B,H3,H4,3. 抗非组 蛋白抗体,抗可溶性核抗原(ENA)抗体：Sm, U1RNP, rRNP, SSA，SSB，

4、Scl70，Jo-1，pM-1，PCNA，RANA，Ku，Mi-1，-2抗体，DNP抗体等。,抗着丝点抗体(Anti-CENP A，B，C，D，F),4. 抗核仁抗体: 抗5rRNA，核小体，U3nRNP，Nor-90抗体。,5. 抗其它细胞成分: 线粒体、中心体等。,抗核抗体,标志性自身抗体：抗Sm抗体对SLE，Scl-70 对SSc，J0-1对PM/DM等 特异性自身抗体：如抗dsDNA抗体对SLE， 抗SS-B抗体对SS等 相关性自身抗体：抗U1RNP抗体对MCTD等 非特异性自身抗体：如 抗高尔基体抗体，抗 过氧化物酶抗体，抗组蛋白抗体等。,二、抗核抗体的分类(2),ANA主要是IgG

5、抗体; ANA无器官特异性和种属特异性； ANA主要存在于血清中；,三、抗核抗体的特性,在约96%的SLE患者的ANA为IgG型，IgM型ANA与类风湿关节炎、药物和年龄相关，通常无明确诊断价值。 但值得注意的是约4%的风湿性疾病患者可为高滴度的IgM型ANA.,ANA主要是IgG抗体; ANA无器官特异性和种属特异性； ANA主要存在于血清中；,三、抗核抗体的特性,血浆能否检测？,肝素锂可能会抑制某些抗原抗体反应； EDAT和枸橼酸盐会螯合血浆中的金属离子增强竞争反应，减弱非竞争反应和荧光分析反应。,ANA可见于多种疾病，特别是结缔组织疾病，常作为结缔组织病的诊断、病情判断和疗效 观察的指标

6、。 高滴度ANA提示有自身免疫性疾病可能。,四、ANA检测的临床意义,ANA检测已成为临床上诊断自身免疫病 的一种重要的指标,系统性红斑狼疮 活动期 非活动期 药物诱导的红斑狼疮 混合性结缔组织病（MCTD、Sharp综合征 类风湿性关节炎 进行性系统性硬化症 多发性肌炎及皮肌炎 干燥综合征 慢性活动性肝炎 溃疡性结肠炎 其它风湿病 正常人,95100% 80100% 100% 100% 2040% 2050% 8595% 3050% 7080% 3040% 26% 5-1%,ANA检测的临床意义,五、ANA 检 测 方 法,一、初筛实验,间接免疫荧光法（IIF）,ELISA法,二、确认实验,

7、免疫印迹法,免疫斑点法,ELISA法,悬浮微列阵技术,蛋白芯片技术,(总抗体）,(特异性抗体）,化学发光检测技术,玻 片,HEp-2细胞,抗核抗体（血清）,荧光标抗IgG,间接免疫荧光法（ IIF）,初筛实验,形成抗原ANA抗人Ig FITC复合物,荧光 阳性,荧光模式的重要性 荧光抗体滴度的重要性,优点： 可同时检测大量抗体，获得较高的检测效率； 可检测到一些至今未知的抗体。,缺点： 1.操作烦杂（现有全自动设备，可解决问题）； 2.需要有经验的人员读片。,间接免疫荧光法（IIF）,ELISA方法,优点： 操作简单，有标准品，可定量； 可观察浓度变化，有助于临床进行 病情及疗效的观察；,1，

8、武永康，王兰兰，等. 抗核抗体不同检测方法的对比分析.中华风湿病学杂志.2006.10(10): 610-614. 2,陈武，董晓枫，等.间接免疫荧光法与酶联免疫吸附试验对比检测抗核抗体.检验医学与临床.2006.3(7):347-348.,初筛实验,缺点： 包被靶抗原量有限，易漏检。,ELISA法与IIF法ANA检测结果 有时不一致,IIF法阳性，ELISA法阴性 原因：,2. ELISA法仅能包被几种（6-10种）自身 抗原,1.太多数IIF法采用HEp-2 细胞作为包被 玻片的基质，大约100 至150 种自身抗 原；,ELISA法与IIF法ANA检测结果 有时不一致,IIF法阴性，EL

9、ISA法阳性 原因： 1. IIF法抗原含量丰富，抗原存在分布不 均、含量过低 ； 2. 不同处理方法对特定抗原有破坏，可能 导致部分特异抗体的漏检； 3. ELISA法方法灵敏度高； 4. 干扰因素：溶血、嗜异性抗体等引起假 阳性。,病 例,患者，男，63岁，无职业，因“发现糖尿病2年，发热9天入院”。曾于2012年8月1日，在白云区红十字会医院就诊，ANA阳性，ds-DNA抗体阳性，为进一步明确诊断来南方医院。 检测结果示：ANA-IIF 为阴性，自身抗体（确认实验）十四项为阴性；ELISA法：ANA为476.99（阳性）， ds-DNA抗体为859.16（阳性）。用定性ds-DNA抗体试

10、剂复查（ELISA)结果为阳性。,用绵羊血对人血清进行中和后，ELISA法的ANA、双链DNA全部阴性。,嗜异性抗体,HEp-2 细胞包含大约100 至150 种自身抗原 其它初筛方法仅具有少量自身抗原,大约 35% SLE患者和IIF-ANA阳性患者在其它初筛实验中为阴性结果,建议筛查实验： IIF-ANA仍然为ANA检测的金标准 实验室在ANA报告当中必须注明ANA检测方法,美国风湿学会(ACR)立场声明,五、ANA 检 测 方 法,一、初筛实验,间接免疫荧光法,ELISA法,(总抗体）,nRNP/Sm 、 Sm、 SS-A、 Scl-70、 SS-B、 Jo-1、 Ro-52 、 CEN

11、P B(着丝点B)、 dsDNA、 核小体、 组蛋白、 核糖体P蛋白、 PM-Scl、 PCNA、 AMA M2,自身免疫性疾病患者体内存在的自身抗 体种类多 不是所有相关纯化抗原都能得到,一种确认实验不能同时检测 所有特异性抗体,确认实验的缺点,自身抗体的检测流程,ANA筛查实验与特异实验同时进行，提高检出率！,特异性抗核抗体检测的 临床意义,Sm、RNP、SSA、SSB、Jo-1、Scl-70 是由许多小分子RNA与各自对应的特定 蛋白质组成的核糖核蛋白颗粒，分子中不含 DNA，称可提取核抗原。,一、ENA抗体谱（可提取性核抗原谱）,extractable nuclear antigens

12、,以患者姓名命名 是SLE的标志性抗体，阳性率为30.2%。在全部抗Sm阳性的病例中，92.2%为SLE。 SLE病人由活动期转为缓解期后，ANA、抗 DNA抗体效价可降低，但Sm抗体依然存在 。因此对早期、不典型的SLE或经治疗缓解后的回顾性诊断有一定意义。,粗颗粒型,U1-nRNP和Sm抗体,抗Sm抗体,SSA抗体主要见于原发性干燥综合征（SS），阳性率高达6075，合并SLE者为30-50%，单纯SLE者为8-10%， 其他结缔组织病极少阳性。,SSA抗体,核细颗粒型,1.SSB抗体是SS血清特异性抗体。在原发性SS阳性 率达40。 2.SSB抗体阳性几乎总伴有抗SSA抗体阳性，其他 自

13、身免疫性疾病中如有抗SSB抗体，常伴有继发 性干燥综合征。 3.在其它结缔组织病中，该两种抗体同时出现， 常提示继发性干燥综合征的存在。 4. 抗SSB和抗SSA抗体相伴出现，有单独的SSA出 现，但单独的SSB出现的少。,SSB抗体,原发性干燥综合征SS,抗nRNP（nuclear RNP）,1.混合性结缔组织病(MCTD)：几乎均为 阳性，且滴度很高，对确立MCTD的诊断很有 帮助。MCTD的抗RNP阳性率95%。,2.其他结缔组织病：抗RNP抗体在其他结缔组织病阳性率较低且滴度低。,3.系统性红斑狼疮（SLE）：抗RNP抗体 在SLE中的阳性率为40%左右。,抗nRNP，无疾病特异性,抗

14、RNP抗体 抗Sm抗体 抗dsDNA抗体,同时存在,则发生狼疮肾炎的可能性较大,抗Scl-70,靶抗原：DNA-拓扑异构酶1的C端末区 系统性硬皮病的标志性抗体,靶抗原：组氨酰tRNA合成酶，一种细胞浆磷酸蛋白。 多发性肌炎/皮肌炎（PM/DM)的标记性抗体 阳性患者多数伴有间质性肺部疾病和多关 节炎及关节痛。 与阴性患者相比，阳性患者发病年龄轻，病情进展快，疗效差，预后较差。,胞浆颗粒型,Jo-1,抗Jo-1抗体,抗dsDNA抗体是SLE患者的特征性抗体，是SLE重要诊断标准之一，诊断的特异性可达95%100%。,二、DsDNA,检测方法主要有,抗dsDNA的检测方法主要有二种,2. ELI

15、SA法,间接免疫荧光法： 特异性高（天然纯化抗原）,可定量，结果可溯源至WHO（TRINITY）； 浓度与病情的活动性呈正相关； 由于方法学原因有时有假阳性。,绿蝇短膜虫为抗原基质检测抗dsDNA抗体,抗dsDNA抗体阴性,抗dsDNA抗体阳性,细胞核荧光,鞭毛基体荧光,动基体荧光,假阳性原因：,ds-DNA抗原的特异性和稳定性： 1.ELISA法使用的抗原是人工纯化抗原，其纯度（抗原特异 性）可直接影响检测结果，如果含有单链DNA、组蛋白等其 他抗原成分，将引起假阳性结果。 2. ds-DNA抗原在纯化包被等生化处理过程中，易造成部分 DNA内部位点暴露，变性解链成ssDNA。,高亲合力和低

16、亲合力抗ds-DNA抗体： 1. 低亲合力抗体除存在于SLE外，也存在于其他AID中，对 SLE诊断价值低；高亲合力抗体，对SLE有较高特异性。 2. 低亲合力抗体适合于ELISA法检测，高亲合力抗体应该用 Farr法最好，其次是IIF法。,Ds-DNA定量,间接免疫荧光法阴性而ELISA阳性：被检血清中可能含有低亲合力抗ds-DNA；或高滴度单链DNA抗体等. 间接免疫荧光法阳性而ELISA阴性：被 检血清中可含有高亲合力抗ds-DNA抗体,建议： 绿荧短膜虫IIF法作为抗双链DNA抗体的确认方法，EILSA法作为疗效观察的方法。,注意：SLE病人经过治疗后，ELISA法滴度可下降、 转阴，

17、但IIF法仍可阳性。,其它自身抗体,1. 抗人IgG分子Fc片段上抗原决定簇的特异性抗 体,分为IgM、G、A、E型.,类风湿因子(RF),2. RF在RA中的阳性率为70%80，是诊断RA的重 要标准之一,3. RF并非RA独有的特异性抗体，对RA的诊断不具 特异性. RF（）不等于一定就是RA，RF（） 也不能排除不是RA,4. RF含量与病情的活动性和严重性成正比，持续 高滴度的RF常提示RA病情活动.,RFrheumatoid factor,CCP抗体,1.瓜氨酸是类风湿关节炎（RA）血清抗聚角蛋白微丝蛋白相关抗体的主要抗原决定簇 2.对RA诊断具有高度特异性（98%） 3.可在RA早

18、期出现,灵敏度约60%，与RF联合检测灵敏度可提高至70%-80% 4.预测早期关节炎的发生（提前35） 5.RA关节侵蚀破坏的早期识别及预测 6.新RA诊断指标中,CCP抗体已列为RA诊断指标之一.,CCP- cyclic citrullinated peptides,1.是针对一组含磷脂结构抗原物质的自身抗体. 2.见于10%15%的SLE,33%49%的RA,是了解疾病进展及是否伴发APS的实验室指标. 2.ACA阳性的患者发生血栓性疾病的危险性增高 3.ACA阳性妇女易发复发生自然流产.,抗心磷脂抗体(ACA),ACA anti-cardiolipin antibody APS ant

19、i-phospholipid syndrome,抗中心粒细胞胞浆抗体(ANCA),1.ANCA是一组以人中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原,与临床多种小血管炎性疾病密切相关的自身抗体。 靶抗原：中性蛋白酶3（PR3），髓过氧化物酶（MPO），杀菌/通透性增高蛋白（BPI），丝氨酸蛋白酶，人白细胞弹性蛋白酶（HLE），乳铁蛋白（LF），组织蛋白酶G，葡萄糖醛酸酶，溶菌酶。 3.是系统性血管炎的标志性抗体,ANCA antineutrophil cytoplasmic antibidies,靶抗原：中性蛋白酶3（PR3） 髓过氧化物酶（MPO）,总ANCA常用间接免疫荧光法,胞浆型ANCAcAN

20、CA，主要靶抗原为PR3,核周型ANCApANCA，主要靶抗原为MPO,韦格纳肉芽肿（WG）的特异性指标 ，阳性率达90%.,特发性坏死性新月体肾小球肾炎，阳性率达80%.,cANCA 和pANCA同时出现，多见变应性肉芽肿性血管炎,显微镜下多血管炎。,一项大型多中心合作的欧洲实验总结。其结果强调大量原发性小血管炎的病人ANCA阴性，因此阴性结果无法排除高度可疑血管炎的病人。,cANCA PR3 pANCA MPO,1、临床需求决定检测模式： 诊断需求，报告时间，经济水平 决定初筛确认是否同时做 2、无AID临床表现的患者： 筛查实验 3、有AID临床表现的患者： 筛查实验和确认实验缺一不可 4、同一医院采用相同方法及相同品牌的试剂盒 检测同一种抗体（建议）,自身抗体检测原则,全国210实验室参加,同一项目相同检测方法不同实验室结果可不一致,5、建立检验与临床沟通平台,检验科及时与临床医师交流相关知识和信息,临床医生及时的将病人信息反馈于检测科， 以便于检验科更好地服务临床。,小 结,1.自身免疫性疾病的概念及特点 2.自身抗体的概念及分类 3.自身抗体的实验室检测及临床意义 1）抗核抗体 4)RF 7) ANCA 2）Ds-DNA 5)CCP 3) ENA 6)ACA,N ENGL J MED 2009;360:711-20.,什么原因导致的 误诊？,谢谢,