生物技术制药-第二章-发酵工程课件.ppt
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1、第二章第二章 发酵工程制药发酵工程制药 1ppt课件第一节第一节 概述概述一、发酵工程一、发酵工程 微生物工程微生物工程:自催化自催化过程过程 完整的工业体系完整的工业体系2ppt课件(一一)发酵的定义发酵的定义1 1、传统发酵、传统发酵最初发酵是用来描述酵母菌最初发酵是用来描述酵母菌 作用于果汁或麦芽汁产生气作用于果汁或麦芽汁产生气 泡的现象,或者是指酒的生泡的现象,或者是指酒的生 产过程。产过程。3ppt课件2 2、生化和生理学意义的发酵、生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下,分解各种有机物质指微生物在无氧条件下,分解各种有机物质产生能量的一种方式,或者更严格地说,发产生能量的一种方
2、式,或者更严格地说,发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出精并放出COCO2 2。4ppt课件3 3、工业上的发酵、工业上的发酵l泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程,包括:包括:1.1.厌氧培养的生产过程,如酒精,乳酸等。厌氧培养的生产过程,如酒精,乳酸等。2.2.通气(有氧)培养的生产过程,如抗生素、通气(有氧)培养的生产过程,如抗生素、氨基酸、酶制剂等。氨基酸、酶制剂等。l产品有细胞代谢产物,也包括菌体细胞、酶产品
3、有细胞代谢产物,也包括菌体细胞、酶等。等。5ppt课件(二二)发酵工业发酵工业定义:是指利用生物的生命活动产生的酶,无定义:是指利用生物的生命活动产生的酶,无机或有机原料进行酶加工,获得产品的工业。机或有机原料进行酶加工,获得产品的工业。6ppt课件发酵食品发酵食品有机酸有机酸氨基酸氨基酸核酸类物质核酸类物质酶制剂酶制剂医药工业(抗生素医药工业(抗生素)饲料工业(单细胞蛋白饲料工业(单细胞蛋白环境工程(废物处理)环境工程(废物处理)其它其它 (冶金工业(冶金工业)抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、
4、生物农药、生物肥料等生物农药、生物肥料等7ppt课件基因工程菌发酵基因工程菌发酵8ppt课件二、发酵类型二、发酵类型1 1、微生物菌体发酵、微生物菌体发酵定义:是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为定义:是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业,包括单细胞的酵母和藻类、目的的产品的发酵工业,包括单细胞的酵母和藻类、担子菌,生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾担子菌,生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。药用微生物制剂等。病用的疫苗等。药用微生物制剂等。9ppt课件特点:细胞的生长与产物积累成平行关系,特点:细胞的生长与产物积累成平行关系,生长速率最大时期也是产物合
5、成速率最高生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段,生长稳定期产量最高。阶段,生长稳定期产量最高。10ppt课件2 2、微生物的酶、微生物的酶目前的酶多数来源于微生物发酵目前的酶多数来源于微生物发酵医用酶制剂的生产医用酶制剂的生产医药工业用酶医药工业用酶酶的特点:易于工业化生产,便于改善工艺提高酶的特点:易于工业化生产,便于改善工艺提高产量。产量。生物合成特点:需要诱导作用,或遭受阻遏、抑生物合成特点:需要诱导作用,或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响,在菌种选育、培养基配制制等调控作用的影响,在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。以及发酵条件等方面需给予注意。11ppt课件3 3、
6、微生物代谢产物发酵、微生物代谢产物发酵包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。谢产物。对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的,称为初级代谢产物或中间代谢产物。需的,称为初级代谢产物或中间代谢产物。各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所停止生长时期即稳定期所 产生的,来自于中间代谢产生的,来自于中间代谢 产物和初级代谢产物。产物和初级代谢产物。12ppt课件1,3-1,3-丙二醇两步发酵法丙二醇两步发酵法糖甘油1,3-丙二醇酵母酵母伯氏肺炎杆菌、丁酸梭
7、菌等伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等13ppt课件4 4、微生物的生物转化、微生物的生物转化定义:是利用生物细胞对一些化合物某一特定定义:是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位(基团)的作用,使它转变成结构相类似部位(基团)的作用,使它转变成结构相类似但具有更多经济价值的化合物。但具有更多经济价值的化合物。最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。一特定部位进行化学反应而形成的。14ppt课件15ppt课件三、微生物发酵生产药物的分类三、微生物发酵生产药物的分类(一)抗生素类(一)抗生素类90009000种种微生物发酵占微生物发酵占
8、7070。有价值的抗生素,几乎全部。有价值的抗生素,几乎全部由微生物生产由微生物生产抗细菌,病毒,真菌,肿瘤,原虫,寄生虫等抗细菌,病毒,真菌,肿瘤,原虫,寄生虫等16ppt课件(二)氨基酸类(二)氨基酸类单个氨基酸制剂:单个氨基酸制剂:复方氨基酸制剂:复方氨基酸制剂:微生物发酵法:微生物发酵法:酶转化法酶转化法黄色短杆菌合成赖氨酸的途径黄色短杆菌合成赖氨酸的途径17ppt课件(三)核苷酸类(三)核苷酸类肌苷酸,肌苷,肌苷酸,肌苷,AMPAMP,ATPATP,辅酶等,辅酶等18ppt课件(四)维生素类(四)维生素类维生素维生素C C的原料药的原料药2-2-酮基酮基-古龙酸,维生素古龙酸,维生素
9、A A的前体的前体B-B-类胡萝卜素,维生素类胡萝卜素,维生素D2D2的前体麦角甾醇,维生的前体麦角甾醇,维生素素B2B2,B12B12等等19ppt课件(四)甾体类激素(四)甾体类激素甾体类激素的生产过程中,甾体类激素的生产过程中,一些特异反应需借一些特异反应需借助微生物的反应。助微生物的反应。20ppt课件(五)治疗酶及酶抑制剂(五)治疗酶及酶抑制剂药用酶药用酶酶抑制剂酶抑制剂21ppt课件四、发酵工程制药特点及发展趋势四、发酵工程制药特点及发展趋势(1 1)菌种是根本)菌种是根本(2 2)理论产量存在)理论产量存在“生物学变量生物学变量”(3 3)常温常压下反应,安全,条件简单)常温常压
10、下反应,安全,条件简单(4 4)纯种培养,防污染)纯种培养,防污染(5 5)可制备复杂高分子化合物)可制备复杂高分子化合物(6 6)分子水平,定向发酵,组合生物合成等)分子水平,定向发酵,组合生物合成等(7 7)发酵工业成本低)发酵工业成本低22ppt课件菌种选育菌种选育自然界选种、诱变育种、自然界选种、诱变育种、基因工程、细胞工程基因工程、细胞工程培养基配制培养基配制根据培养基的配制原则制备,根据培养基的配制原则制备,实践中需多次试验配方实践中需多次试验配方灭菌灭菌杀灭杂菌(胞体、孢子杀灭杂菌(胞体、孢子及芽孢)及芽孢)扩大培养和接种扩大培养和接种发酵过程(中心阶段)发酵过程(中心阶段)检测
11、进程,满足营养需要;检测进程,满足营养需要;严格控制温度、严格控制温度、pH、溶氧、溶氧、转速等转速等分离纯化分离纯化菌体:过滤、沉淀;代谢产物:菌体:过滤、沉淀;代谢产物:蒸馏、萃取、离子交换蒸馏、萃取、离子交换发酵工程基本流程发酵工程基本流程23ppt课件发酵的基本过程发酵的基本过程发酵的基本过程发酵的基本过程:菌种菌种 种子制备种子制备 发酵发酵 预处理预处理 提取精制提取精制24ppt课件典型发酵过程典型发酵过程25ppt课件第二节、发酵工程中的微生物第二节、发酵工程中的微生物一、常见的药用微生物一、常见的药用微生物发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌,发酵工程所利用的微生物主要是
12、细菌、放线菌,酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌细菌细菌放线菌放线菌26ppt课件(一)细菌(一)细菌主要生产氨基酸,核苷酸,维生素等主要生产氨基酸,核苷酸,维生素等27ppt课件(二)(二)放线菌放线菌产抗生素最多的一类微生物产抗生素最多的一类微生物另外生产另外生产B12,B12,酶,甾体转化酶,甾体转化抗生素是次级代谢产物,需要生物体进行复杂的抗生素是次级代谢产物,需要生物体进行复杂的代谢,目前发现的生物来源如下:代谢,目前发现的生物来源如下:放线菌(链霉素;四放线菌(链霉素;四环素;红霉素等)环素;红霉素等)真菌(青霉素、头孢等)真菌(青霉素、头孢等)一些产芽孢的细菌一些产芽孢的细菌植物或动物来源
13、植物或动物来源链霉菌链霉菌28ppt课件(三)真菌(三)真菌抗生素抗生素维生素维生素酶制剂酶制剂有机酸等有机酸等药用真菌(大型真菌)药用真菌(大型真菌)29ppt课件1.1.藻状菌纲:根霉;犁头霉藻状菌纲:根霉;犁头霉2.2.子囊菌纲:酵母子囊菌纲:酵母3.3.担子菌纲:牛肝菌,灵芝担子菌纲:牛肝菌,灵芝4.4.半知菌纲:曲霉;青霉;头孢酶半知菌纲:曲霉;青霉;头孢酶30ppt课件二、生产菌种的选育二、生产菌种的选育工业化菌种的要求工业化菌种的要求1.1.遗传性能要相对稳定遗传性能要相对稳定2.2.生长速度快,不易感染它种微生物或噬菌体生长速度快,不易感染它种微生物或噬菌体3.3.目标产物产量
14、接近理论转化值目标产物产量接近理论转化值4.4.目标产物分泌到胞外目标产物分泌到胞外5.5.尽可能减少类似物产量尽可能减少类似物产量6.6.能够利用廉价的原料,简单的培养基,大量高能够利用廉价的原料,简单的培养基,大量高效地合成产物效地合成产物31ppt课件自然状态下,碱基对发生自然突变的机率为自然状态下,碱基对发生自然突变的机率为1010-8-81010-9-9一种是我们生产上所不希望看到的,表现为菌一种是我们生产上所不希望看到的,表现为菌株的衰退和生产质量的下降,这种突变成为负株的衰退和生产质量的下降,这种突变成为负突变突变。另一种是我们生产上希望看到的,对生产有利,另一种是我们生产上希望
15、看到的,对生产有利,这种突变成为正突变。这种突变成为正突变。(1 1)自然选育)自然选育32ppt课件1采样采样33ppt课件2.2.分离菌株分离菌株34ppt课件自然选育操作步骤:自然选育操作步骤:一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。平板分离平板分离(注意形态的观察注意形态的观察)发酵试验发酵试验单细胞单细胞(孢子孢子)悬液的制备悬液的制备挑选单菌落挑选单菌落礼来公司花了礼来公司花了1010年的时间从年的时间从4040万株微生物万株微生物中,发现了三中,发现了三种有潜力的新种有潜力的新抗生素。抗生素。35ppt课件(2)2)自发突变与定向育种自发突
16、变与定向育种一定情况下,长期处理微生物并移种,累积自发一定情况下,长期处理微生物并移种,累积自发突变体突变体结构类似物结构类似物:在化学和空间结构上和代谢的中间:在化学和空间结构上和代谢的中间物(终产物)相似,因而在代谢调节方面可以代物(终产物)相似,因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物(终产物)的功能,但细胞不能以替代谢中间物(终产物)的功能,但细胞不能以其作为自身的营养物质。其作为自身的营养物质。筛选抗性株,可成为高产株筛选抗性株,可成为高产株抗性突变株的筛选抗性突变株的筛选36ppt课件直接从自然界分离得到的菌株为直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株野生型菌株。往往低产甚至不产所需的产
17、物,只有经过进一往往低产甚至不产所需的产物,只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产步的人工改造才能真正用于工业生产 菌种选育菌种选育突变、体内重组突变、体内重组体外重组(基因工程)体外重组(基因工程)37ppt课件(3 3)诱变育种)诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选,称为诱变育种筛选,称为诱变育种诱变剂:能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂:能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂诱变剂物理:紫外线,快中子物理:紫外线,快中子化学:硫酸二乙酯,亚硝基胍化学:硫酸二乙酯,亚硝基胍,5-Br-U5-Br-U38p
18、pt课件物理诱变剂物理诱变剂:紫外线、:紫外线、X-X-射线、射线、-射线,快中射线,快中子;目前使用得最方便而且十分有效的是子;目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线,对于一般实许多高产菌株的选育都用过紫外线,对于一般实验室、中小型工厂都适用,也很安全。验室、中小型工厂都适用,也很安全。化学诱变剂化学诱变剂:碱基类似物、:碱基类似物、5-5-氟尿嘧啶、烷化剂氟尿嘧啶、烷化剂等。使用最多、最有效的是等。使用最多、最有效的是烷化剂烷化剂。大多数情况。大多数情况下,就突变数量而言,要比电离辐射更有效下,就突变数量而言,要比电离辐射更有效39ppt课件诱变育种步
19、骤诱变育种步骤出发菌株的选择出发菌株的选择处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备诱变处理诱变处理中间培养中间培养分离和筛选分离和筛选筛选的方法筛选的方法q 随机筛选随机筛选q 形态形态q 理性化筛选理性化筛选40ppt课件(4 4)杂交育种)杂交育种通过有性生殖进行通过有性生殖进行41ppt课件(5)(5)原生质体融合原生质体融合两个细胞融合两个细胞融合1.1.原生质体融合的一般程序原生质体融合的一般程序去细胞壁融合筛选去细胞壁融合筛选2.2.酶酶 溶菌酶,纤维素酶,蜗牛酶溶菌酶,纤维素酶,蜗牛酶42ppt课件基因突变:基因突变:自然选育、诱变育种自然选育、诱变育种基因重组基因重组:杂交、原生质体融
20、合、基因工杂交、原生质体融合、基因工程程基因的直接进化基因的直接进化:点突变、易错点突变、易错PCRPCR、同序法、同序法DNA ShufflingDNA Shuffling等等(6 6)基因重组进化育种)基因重组进化育种43ppt课件44ppt课件错位PCR45ppt课件基本步骤基本步骤 (1)(1)用用DNaseDNase I I消化功能消化功能相同的一组基因片段相同的一组基因片段(A)(A),从而产生随机小片段从而产生随机小片段(B)(B)。(2)(2)经提纯后,用无引物经提纯后,用无引物(经变经变性后可互为引物性后可互为引物)的类似的类似PCRPCR反反应重新装配这些小片段成完整应重新
21、装配这些小片段成完整长度的重组基因片段长度的重组基因片段(C)(C),在,在装记过程中被证明有低水平点装记过程中被证明有低水平点突变产生。突变产生。3)3)克隆并选择正突变体克隆并选择正突变体(D)(D),并将正突变体的重组基因并将正突变体的重组基因片段作新一轮的体外重组。片段作新一轮的体外重组。46ppt课件项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组低DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组高DNA ShufflingDNA Shuffling与常规定向进化的比较与常规定向进化的比较47ppt课件从产物形成的生理生化途
22、径着手,进行有的放矢从产物形成的生理生化途径着手,进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等,筛的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等,筛选而产生的这些特性,称为遗传标记。选而产生的这些特性,称为遗传标记。1.1.自身耐药突变株自身耐药突变株2.2.结构类似物或前体类似物的耐受突变株结构类似物或前体类似物的耐受突变株3.3.营养缺陷及其回复突变株营养缺陷及其回复突变株筛选筛选48ppt课件饱浸含某种指示饱浸含某种指示剂的固体培养基剂的固体培养基的滤纸片变色圈的滤纸片变色圈 指示剂直接掺入或喷洒固指示剂直接掺入或喷洒固体培养基,菌落周围形成体培养基,菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上变色
23、圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液喷上稀碘液 固体培养基中渗入溶解性固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营差、可被特定菌利用的营养成分,造成不透明的培养成分,造成不透明的培养基背景。菌落利用此物养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。质形成透明圈。利用一些有特别营养要利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌,求的微生物作为工具菌,如待筛选菌具有该营养如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物物的前体转化成营养物 能力,工具菌就能围绕能力,工具菌就能围绕该菌生长该菌生长 待筛选的菌株能待筛选的菌株能分泌产生某些能分泌产生某些能抑制工具菌生长抑制工具菌生长的物质的物质 49ppt课件三、菌种保藏三、菌种
24、保藏在生产发酵中,具有高产有重要经济价值的某一期在生产发酵中,具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏,待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏,对于一成功的工业发酵过程极为重要。对于一成功的工业发酵过程极为重要。斜面低温法:短期保存斜面低温法:短期保存石蜡油封存法:中期保存石蜡油封存法:中期保存沙土管:产孢子和芽孢的沙土管:产孢子和芽孢的麸皮保存法:产孢子的霉菌和放线菌,工厂用麸皮保存法:产孢子的霉菌和放线菌,工厂用甘油悬液法:基因工程菌甘油悬液法:基因工程菌50ppt课件冻干保藏冻干保藏 :最广泛使用的方法。大部分菌种可以:最广泛使用的方法。大部分菌种
25、可以在冻干状态下保藏在冻干状态下保藏1010年之久。且经冻干后的菌株年之久。且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏,便于运输无需进行冷冻保藏,便于运输液氮法:最为有效,保藏液氮法:最为有效,保藏1515年以上,年以上,宿主保藏法:活细胞内寄生的微生物宿主保藏法:活细胞内寄生的微生物51ppt课件第三节、发酵设备及消毒灭菌第三节、发酵设备及消毒灭菌一、发酵设备一、发酵设备52ppt课件发酵罐是发酵工程中最重要的设备之一发酵罐是发酵工程中最重要的设备之一一个优良的培养装置应一个优良的培养装置应具有:具有:严密的结构严密的结构良好的液体混合性能良好的液体混合性能高的传质和传热速率高的传质和传热速率灵敏的检
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