分子医学技能实验课件：分子医学技能-实验三.ppt

1、分子医学技能分子医学技能-实验三实验三n琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNADNA片段的标准片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的（如密度梯度离心法）所无法分离的DNADNA片段。当片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium(Ethidium bromide,EB)bromide,EB)染色染色,在紫外光下至少可以检出在紫外光下至少可以检出1-1-10ng10ng的的D

2、NADNA条带条带,从而可以确定从而可以确定DNADNA片段在凝胶中的片段在凝胶中的位置。此外位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNADNA条带条带,用于以后的克隆操作。用于以后的克隆操作。原理：原理：在在 pH pH 值为值为 8.08.08.3 8.3 时，核酸分子碱基几乎不解时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的物，在分子筛的作用下，使分子大小

3、和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如料（如 EB EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。在的位置。琼脂糖电泳分离琼脂糖电泳分离DNADNA的范围的范围 琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖凝胶分离凝胶分离DNADNA片度大小范围较广片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从胶可分离长度从200bp200bp至近至近50kb

4、50kb的的DNADNA片段。琼脂糖片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。电泳指示剂电泳指示剂 核酸电泳常用的指示剂有两核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（种，溴酚蓝（bromophenol bromophenol blue,Bb blue,Bb）呈蓝紫色；二甲）呈蓝紫色；二甲苯晴（苯晴（xylene cyanol,Xc xylene cyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。溴酚蓝慢。胶浓胶浓（%）溴酚蓝溴酚蓝二甲苯二甲苯青青0.61kb1

5、0.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb影响凝胶电泳的因素影响凝胶电泳的因素 DNA DNA的分子大小、构象的分子大小、构象 线状双链线状双链DNADNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNADNA分子量对数成反比。分子量对数成反比。超螺旋超螺旋DNADNA移动最快移动最快,开环其次、线状双链开环其次、线状双链DNADNA移动最慢。移动最慢。琼脂糖浓度琼脂糖浓度一个给定大小的线状一个给定大小的线状DNADNA分子分子,其迁移速度在不同浓度其迁移速度在不同浓度琼脂糖凝胶中各不相同。琼脂糖凝胶中各不相同。DNADNA电泳迁移率的对数与凝胶

6、浓电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNADNA分子的大小。分子的大小。影响凝胶电泳的因素影响凝胶电泳的因素电源电压电源电压 在低电压时在低电压时,线状线状DNADNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但电压增加，琼片段的迁移速率与所加电压成正比。但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb2kb的的DNADNA片段的分辨率达到最大片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过所加电压不得超过5v/cm5v/cm。嵌入染料的存在嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的荧光染料溴化乙

7、啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状之间并拉长线状和带缺口的环状DNADNA，使其刚性更强，使其刚性更强,还会使线状还会使线状DNADNA迁移率迁移率降低降低1515。离子强度影响离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNADNA的电泳迁移率。在没有离子存在时的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶如误用蒸馏水配制凝胶),),电导率最小电导率最小,DNA,DNA几乎不移动几乎不移动,在高离子强度的缓冲在高离子强度的缓冲液中液中(如误加如误加1010电泳缓冲液电泳缓

8、冲液),),则电导很高并明显产热则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔严重时会引起凝胶熔化或化或DNADNA变性。变性。琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、1%倒胶倒胶3mm、凝固后拔梳）、凝固后拔梳）倒缓冲液，加样（样品中加入倒缓冲液，加样（样品中加入1/5体积的上样体积的上样buffer）电泳（方向、电压、时间）电泳（方向、电压、时间）染色与检测（染色与检测（EB10 min，紫外检测），紫外检测）注意事项注意事项倒胶时把握好胶的温度，不要高于倒胶时把握好胶的温度，不要高于60 60，否则温度太高会，否则温度太高会使制板变形使制板变形胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔弄坏点样孔点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多EBEB有毒（现在用低毒的染料，好一点），切勿用手接触，有毒（现在用低毒的染料，好一点），切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔更不要污染环境，胶勿乱扔紫外线照射不要太久紫外线照射不要太久M S1 S2