分子医学技能实验课件：本科实验一-基因组DNA的提取与纯化.ppt

1、分子医学技能分子医学技能银银 巍巍Email： 利用基因组利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻璃棒将其取出，而小分子漂浮其中，可用玻璃棒将其取出，而小分子DNA则则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。的目的。主要试剂的功能主要试剂的功能 抽提缓冲液：由抽提缓冲液：由SDS、EDTA、蛋白酶、蛋白酶K组成组成.w S

2、DS的作用是裂解细胞的作用是裂解细胞.w EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止防止DNA 酶对酶对DNA分子的降解作用。分子的降解作用。w 蛋白酶蛋白酶K的作用是水解蛋白质。的作用是水解蛋白质。酚和氯仿酚和氯仿/异戊醇：抽提分离蛋白质异戊醇：抽提分离蛋白质 乙醇：沉淀乙醇：沉淀DNA TE：溶解：溶解DNA取材取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水用生理盐水漱口后，口含生理盐水1015ml约约23min，用，用15ml离心管（离心管（4000rpm 10min）收集细胞沉淀）收集细胞沉淀 （台式离心机的使用，平衡）（台式离心机的使用，平衡）加入加入0.5m

3、l抽提缓冲液，重悬沉淀抽提缓冲液，重悬沉淀 ，转移至，转移至1.5ml EP管管 （微量移液器的正确使用）（微量移液器的正确使用）混匀，混匀，65 温育温育15min 加入等体积的饱和酚加入等体积的饱和酚(0.5ml)，充分颠倒混匀，充分颠倒混匀（不要震荡！）（不要震荡！）实验步骤及注意事项（一人一组）：实验步骤及注意事项（一人一组）：12000rpm 5min，400ul上层水相转移至上层水相转移至新的新的EP管管 （高速离心机的使用与安全意识）高速离心机的使用与安全意识）加入加入400ul等体积氯仿等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀异戊醇，颠倒混匀12000rpm 5min，400ul上层水相转

4、移到上层水相转移到新的新的EP管管 加入加入2倍体积倍体积800ul95%的乙醇，颠倒混匀的乙醇，颠倒混匀12000rpm 5min 弃上清，沉淀中加入弃上清，沉淀中加入1ml75%乙醇乙醇 12000rpm 2min 轻轻弃去上清，打开轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置盖，室温静置510min 加入加入30 l0.1TE溶液，溶液，42 助溶助溶10min后后4 保存保存 定性分析：定性分析：DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 定量分析：紫外分光光度法测定定量分析：紫外分光光度法测定DNA溶液溶液 的浓度的浓度 常见问题：常见问题：1、提取的、提取的DNA不纯：不纯：变性不充分；关键过程反应时间过短；变性不充分；关键过程反应时间过短；离心时间或速度不够。离心时间或速度不够。2、提取的、提取的DNA成涂布状：成涂布状：操作过程中用力过猛，动作粗暴；操作过程中用力过猛，动作粗暴；操作系统有污染。操作系统有污染。3、与细胞器、与细胞器DNA分离不全；分离不全；变性过程不完全；变性过程不完全；试剂配置问题。试剂配置问题。操作按钮容量刻度套头操作按钮容量刻度套头 20 l1000 l100 l1001002000.5-10l20-200l100-1000l1 0.02 0 01 0 0 0切记:看着刻度调大小刻度刻度