仪器分析高效液相色谱法课件.ppt
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1、ppt课件1 第四章第四章 高效液相色谱法高效液相色谱法 ppt课件2ppt课件3 本章本章要求要求 了解高效液相色谱法的优缺点了解高效液相色谱法的优缺点 了解高效液相色谱仪的结构了解高效液相色谱仪的结构 掌握常用检测器的原理及应用范围掌握常用检测器的原理及应用范围ppt课件4定义:以液体作为流动相的色谱法称为液相色谱法定义:以液体作为流动相的色谱法称为液相色谱法高效液相色谱法(高效液相色谱法(HPLC):):20世纪世纪60年代末年代末70年代年代技术:技术:高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器特点:速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化特点:速度快、效率高、灵
2、敏度高、操作自动化一一、概述概述4.1 高效液相色谱法简介高效液相色谱法简介ppt课件51高效液相色谱法与经典液相色谱法比较高效液相色谱法与经典液相色谱法比较 高速:高速:HPLC分离效率高,速度快,一次几分钟和几十分钟分离效率高,速度快,一次几分钟和几十分钟就可完成。色谱柱的寿命长,可达两年以上。就可完成。色谱柱的寿命长,可达两年以上。高效:高效:HPLC高压高压(26 MPa)下操作,填料颗粒小下操作,填料颗粒小(250 m),规则均匀的固定相,传质阻力小,柱效高规则均匀的固定相,传质阻力小,柱效高(N=400060000 块块/m),分离效率高。,分离效率高。高灵敏度:高灵敏度:现代高效
3、液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器,现代高效液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器,使分析灵敏度比经典色谱有大提高(紫外检测器最小检测使分析灵敏度比经典色谱有大提高(紫外检测器最小检测限可达限可达10-9 g;荧光检测器最小检测限可达;荧光检测器最小检测限可达10-1110-13 g。高自动化:高自动化:HPLC进样量小进样量小(XX0 L)。带有自动进样装置。带有自动进样装置和工作站。和工作站。ppt课件62高效液相色谱法与气相色谱法的比较高效液相色谱法与气相色谱法的比较 适用范围适用范围 GC适用于沸点低、热稳定性好、中小分子量的化合物,适用于沸点低、热稳定性好、中小分子量的化合物,HPLC不受此
4、种限制。气相色谱一般都在不受此种限制。气相色谱一般都在较高温度较高温度下进行,下进行,而高效液相色谱法则经常可在而高效液相色谱法则经常可在室温条件室温条件下工作。下工作。流动相流动相 GC流动相仅运载样品,不起分离作用,但无毒,易于流动相仅运载样品,不起分离作用,但无毒,易于处理。而处理。而HPLC流动相除了运载样品外,还有分离作用,可流动相除了运载样品外,还有分离作用,可改变流动相组成,进行有效的分离。但流动相一般有毒,费改变流动相组成,进行有效的分离。但流动相一般有毒,费用高。用高。ppt课件7 色谱柱色谱柱 GC柱很长,特别是毛细管柱可长至几十米至上百米,柱效柱很长,特别是毛细管柱可长至
5、几十米至上百米,柱效很高很高(理论塔板数理论塔板数N=104106)。HPLC柱较短,一般为柱较短,一般为1525 cm,柱效,柱效(理论塔板数理论塔板数N=103104),低于,低于GC柱。柱。检测器检测器 与与GC相比,相比,HPLC检测器种类较多。检测器种类较多。制备色谱制备色谱 GC难以制备样品,因为进样量小,难以收集或被破坏。难以制备样品,因为进样量小,难以收集或被破坏。HPLC可进行制备,即制备色谱。可进行制备,即制备色谱。ppt课件8一一高效液相色谱仪的结构高效液相色谱仪的结构 4.2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪ppt课件9一般一般分为分为4个主要个主要部分:部分:高压输液系统
6、、进样系统、分高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。离系统和检测系统。此外还配有辅助装置:如梯度洗此外还配有辅助装置:如梯度洗脱、自动进样及数据处理等。脱、自动进样及数据处理等。工作过程如下:工作过程如下:首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱,然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样色谱柱,然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时,流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱品时,流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离,然后依先后顺序进入检测器,记录仪将检柱进行分离,然后依先后顺序进入检测器,记录仪将检测器送出的信
7、号记录下来,由此得到液相色谱图。测器送出的信号记录下来,由此得到液相色谱图。ppt课件10数据分析系统输液系统输液系统进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统HPLC的系统组成的系统组成数据处理系统数据处理系统ppt课件111.高压输液系统:高压输液系统:一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成,其中高压输液泵是核心部件。成,其中高压输液泵是核心部件。高压泵应满足如下要求:高压泵应满足如下要求:流量恒定,无脉动,并有较大的调节范围。流量恒定,无脉动,并有较大的调节范围。能抗溶剂的腐蚀,耐酸、耐碱。能抗溶剂的腐蚀,耐酸、耐
8、碱。有较高的输送压力。一般分离,有较高的输送压力。一般分离,6.0104 Pa压力;高效分压力;高效分离,要求达到离,要求达到1.53.0107 Pa的压力或更高。的压力或更高。泵的死体积要小,便于迅速更换溶剂和进行梯度淋洗。泵的死体积要小,便于迅速更换溶剂和进行梯度淋洗。ppt课件12常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种:恒流泵恒流泵 是在一定操作条件下,输出流量恒定,与是在一定操作条件下,输出流量恒定,与色谱柱引起阻力变化无关。色谱柱引起阻力变化无关。恒压泵恒压泵 能保持输出压力恒定,其流量随色谱系统能保持输出压力恒定,其流量随色谱系统阻力而变化,保留时间的
9、重现性差。阻力而变化,保留时间的重现性差。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵,恒流泵又称机械目前恒流泵正逐渐取代恒压泵,恒流泵又称机械泵,又分泵,又分机械注射泵和机械往复泵机械注射泵和机械往复泵两种,应用最多两种,应用最多的是的是机械往复泵机械往复泵。ppt课件13ppt课件14 ppt课件15 ppt课件16在分离过程中,使流动相的在分离过程中,使流动相的组成、极性、组成、极性、pH等等按一定程序连续变化,使样品中各组分能在按一定程序连续变化,使样品中各组分能在最最佳条件下佳条件下出峰,保留时间短、拥挤不堪甚至重出峰,保留时间短、拥挤不堪甚至重叠的组分和保留时间过长而峰形扁平的组分获叠的组分和保留时
10、间过长而峰形扁平的组分获得很好的分离。得很好的分离。通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力,梯,梯度洗脱装置将两种或三种、四种溶剂按一定比度洗脱装置将两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱。例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱。ppt课件17梯度洗脱的优点:梯度洗脱的优点:改善峰形;改善峰形;提高柱效;提高柱效;减少分析时间;减少分析时间;使强烈滞留的组分不容易残留在柱上,保持良好的柱性能使强烈滞留的组分不容易残留在柱上,保持良好的柱性能(但进行下次分析时,更换流动相达到平衡时间长)。(但进行下次分析时,更换流动相达到平衡时间长)。梯度洗
11、脱梯度洗脱与气相色谱的与气相色谱的程序升温程序升温十分类似,两者的目的相十分类似,两者的目的相同,不同的是程序升温是通过同,不同的是程序升温是通过改变柱温改变柱温,而液相色谱的梯,而液相色谱的梯度洗脱是度洗脱是通过改变流动相的组成、极性、通过改变流动相的组成、极性、pH来达到来达到改变改变k的目的的目的。ppt课件18在高效液相色谱中,常用的进样方式:在高效液相色谱中,常用的进样方式:高压阀进样:高压阀进样:优点是能用于高压,适于大体积进样,重现性优点是能用于高压,适于大体积进样,重现性好;缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样,不同的进样好;缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样,不同的进样量需用不
12、同的量需用不同的定量管定量管,同时峰的扩展也比注射进样大。,同时峰的扩展也比注射进样大。微量注射器进样:微量注射器进样:也可由微量注射器注入取样环少量样品,也可由微量注射器注入取样环少量样品,即采用较大体积取样环而进少量试样,进样量由注射器控即采用较大体积取样环而进少量试样,进样量由注射器控制,试样不充满取样环,只填充一部分体积。制,试样不充满取样环,只填充一部分体积。2.进样系统进样系统ppt课件193.分离系统分离系统-色谱柱色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件,它包括柱管与固色谱柱是液相色谱的心脏部件,它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及定相两部分。柱管材料有玻璃、不
13、锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其它金属。玻璃管耐压有限,内衬光滑的聚合材料的其它金属。玻璃管耐压有限,故金属管用得较多。一般色谱柱长故金属管用得较多。一般色谱柱长1530 cm,内径,内径为为45 mm,凝胶色谱柱内径,凝胶色谱柱内径312 mm,制备柱内径,制备柱内径较大,可达较大,可达25 mm 以上。以上。ppt课件20 固定相固定相 表面多孔固定相表面多孔固定相 全多孔微粒固定相全多孔微粒固定相直径直径210 m,孔径,孔径2100 nm,比表面积比表面积x00 x0m2/g。现在最广泛采用的填料是全多孔微粒硅胶现在最广泛采用的填料是全多孔微粒硅胶12 m直径直径1025 mppt
14、课件21 化学键合固定相化学键合固定相 化学键合相色谱柱化学键合相色谱柱 虽然可将固定液机械地涂附在上述表面多孔硅胶或虽然可将固定液机械地涂附在上述表面多孔硅胶或全多孔硅胶上作固定相,但有许多缺点,因此现在多全多孔硅胶上作固定相,但有许多缺点,因此现在多采用化学键合固定相。采用化学键合固定相。化学键合固定相是在表面多孔化学键合固定相是在表面多孔或全多孔硅胶表面上利用化学反应法通过化学键把有或全多孔硅胶表面上利用化学反应法通过化学键把有机分子结合在载体表面。机分子结合在载体表面。键合类型:键合类型:疏水基团:如疏水基团:如C8、C18;极性基团:极性基团:如丙氨基如丙氨基(-C3H6NH2)、氰
15、乙基、氰乙基(-C2H4CN);ppt课件22 离子交换基团,如阴离子交换(离子交换基团,如阴离子交换(-NR3Cl)、阳离子)、阳离子(-SO3H);键合途径:);键合途径:SiOC 键型键型 SiOSiC 键型键型 (最常用最常用)SiC 键型键型Si-OHROHSi-O-RH2OSi-OH R3SiClSi-O-SiR3HClSi-OHSOCl2Si-Cl(+SO2+HCl)Si-R(+MgCl2)RMgClppt课件23o煤煤油油H2OCH3CNCH3OH 流动相流动相 正相色谱正相色谱 极性:流动相固定相极性:流动相固定相 反相色谱反相色谱 极性:流动相固定相极性:流动相固定相a 流
16、动相纯度要高,与流动相纯度要高,与固定相不相溶固定相不相溶,不发生不发生化学反应化学反应b 价格便宜,毒性小,易于纯化价格便宜,毒性小,易于纯化c 对试样溶解度适宜,不发生沉淀对试样溶解度适宜,不发生沉淀d 粘度小粘度小e 与检测器匹配与检测器匹配极性顺序:水乙腈甲醇四氢呋喃环己烷煤油极性顺序:水乙腈甲醇四氢呋喃环己烷煤油ppt课件244.检测系统检测系统 在液相色谱中,有两种基本类型的检测器在液相色谱中,有两种基本类型的检测器:溶质性检测器溶质性检测器:仅对被分离组分的物理或化学特性仅对被分离组分的物理或化学特性有响应,有紫外有响应,有紫外UVD、荧光、荧光FD、二极管阵列检测器、二极管阵列
17、检测器DAD等。等。总体检测器:对试样和洗脱液总的物理或化学性质总体检测器:对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应,有示差折光检测器有响应,有示差折光检测器RID、电化学检测器、电化学检测器ECD、蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器ELSD和质谱检测器和质谱检测器MSD等。等。P65,表,表4-3ppt课件25药典中的液相色谱检测器药典中的液相色谱检测器ppt课件26常用的检测器常用的检测器:(1)紫外光度检测器:紫外光度检测器:是一种选择性浓度检测器,仅是一种选择性浓度检测器,仅对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。作用原理:基于待测试样对特定波长的紫外光有选
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