MLVA分型技术和实验操作步骤课件.ppt

1、多位点可变数目串联重复序列多位点可变数目串联重复序列（MLVA）分型技术和操作步骤）分型技术和操作步骤李李 伟伟中国CDC 传染病所传染病预防控制国家重点实验室PulseNet China第一期培训 2010-06-192010-06-19 1ppt课件病原菌分子分型的目的病原菌分子分型的目的 长期研究长期研究 病原菌的遗传进化病原菌的遗传进化 病原菌适应来自宿主的高选择性压力病原菌适应来自宿主的高选择性压力 因点突变、重组（包括基因转移）等遗传变异因点突变、重组（包括基因转移）等遗传变异 短期研究短期研究 了解病原菌的适应性了解病原菌的适应性 感染溯源感染溯源2ppt课件分子分型方法分子分型

2、方法 序列或分类资料为基础的等位基因：序列或分类资料为基础的等位基因：多位点序列分析（多位点序列分析（multilocus sequence typing，MLST）多位点可变数目串联重复序列分析（多位点可变数目串联重复序列分析（Multiple-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis,MLVA）图像分析：图像分析：脉冲场凝胶电泳（脉冲场凝胶电泳（PFGE)随机扩增多态性随机扩增多态性DNA分析（分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD)扩增片断长度多态性分析（扩增片断长度多态性分析（amplified

3、fragment length polymorphism,AFLP）核糖体分型（核糖体分型（ribotyping）等等3ppt课件MLST 结果无偏性结果无偏性unambiguous results 有相应的数据库支持有相应的数据库支持 international databases 区分度低，区分度低，Low discrimination power 高花费，高花费，high cost:sequencing 不适合常规检测和暴发调查，不适合常规检测和暴发调查，unsuitable for routine surveillance and epidemiological studies4ppt

4、课件VNTR VNTR：可变数目出那里重复序列，：可变数目出那里重复序列，Variable Number of Tandem Repeats AACTTTACGTTCAAATTAACGTTCAAATTAACGTTCAAATTTACCTTG 侧侧 翼翼 序序 列列重复单元重复单元5ppt课件18bp*3 AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGCTGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGAVNTR产生的原因：聚合酶的滑链复制产生的原因：聚合酶的滑链复制6ppt课件 100 bp200 b

5、p 300 bpGel migrationStrain CDC1551:5 x 15 bpStrain H37Rv:4 x 15 bpstrain CDC1551:230 bpstrain H37Rv:215 bp230 bp215 bp200 bpPCR primers:CTCCCACACCCAGGACACCGGCCTACCCAACATTCCPCR215 bp230 bp TRF 软件（软件（Tandem Repeats Finder software），），:/minisatellites.u-psud.fr/VNTR VNTR 位点的确定位点的确定测序分析测序分析7ppt课件VNTR和等

6、位基因和等位基因atgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgatPrimer-F上游序列VNTR 重复重复下游序列重复拷贝数重复拷贝数=扩增大小-上下游序列 重复单元的大小Primer-R 取整：就近取整或去除小数取整8ppt课件串联重复序列可变重复数目的判定串联重复序列可变重复数目的判定9ppt课件MLVA方法方法 多位点可变数目串联重复序列分析多位点可变数目串联重复序列分析 可变数目串联重复：可变数目串联重复：VNTR：MLVA方法：即方法：即VNTR的数组的数组 例如：例如：MLVA1型型 735 2 6 6 2 10 2 3 3 1 36 ST1 +

7、-MLVA1型别型别 菌株菌株 血清型血清型 TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 MLST 其他特征其他特征MLVA14 1046 15 3 1.7 1 9 1 2 3 0 26 ST81 -10ppt课件分析软件：BioNumerics 命名MLVA型：MT1-MT85 评价各位点的分辨力：Neis index=1-(allele frequency)2 评价MLVA方法的分辨力：Simpsons index=1-nj(nj-1)/N(N-1)聚类分析 构建最小生成树11ppt课件MLVA MLVA 实验操作实验操作一、模板制备：一、模板制备：DNA提取模

8、板或水煮模板提取模板或水煮模板二、二、PCR 扩增扩增 多重多重PCR反应反应三、扩增条带大小判断：三、扩增条带大小判断：（一）毛细管电泳：（一）毛细管电泳：1.引物标记引物标记 2.多种不同的荧光染料标记上游引物（多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM、HEX 和和TAMRA）3.ABI 3730系统进行分析，系统进行分析，用内标（用内标（ABI自带）自带）（二）普通电泳分析（二）普通电泳分析（三）测序分析（三）测序分析12ppt课件MLVAMLVA实验步骤实验步骤-PCR-PCR2 2个个PCRPCR体系体系/多重多重PCRPCR体系：体系：体系（20ul）指标BufferdNTP上下游引

9、物10uM（个ul）酶模板ulTm延伸时间循环数片段大小判断方式A1TR2-FAM2.01.50.20.3u0.75640秒30毛细管电泳TR4-HEX0.3A2TR1-FAM2.01.50.20.3u0.75740秒30毛细管电泳TR3-HEX0.3模板制备：模板制备：DNA提取模板提取模板水煮模板水煮模板13ppt课件扩增条带大小判断：扩增条带大小判断：（一）毛细管电泳：（一）毛细管电泳：1.引物标记引物标记 2.多种不同的荧光染料标记上游引物多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM、HEX 和和TAMRA）3.ABI 3730系统进行分析，系统进行分析，用内标用内标（ABI自带）自带）（二

10、）普通电泳分析（二）普通电泳分析（三）测序分析（三）测序分析14ppt课件用用500liz内标标定扩增片段大小用内标标定扩增片段大小用genemap软件分析毛细管电泳图软件分析毛细管电泳图用毛细管电泳来判断片段大小用毛细管电泳来判断片段大小15ppt课件MLVA聚类分析 Bionumerics 软件（软件（version 4.64）效用均等的分类资料的分析方法效用均等的分类资料的分析方法（UPGMA）(unweighted pair group method using arithmetic averages)等分权重等分权重 分类图分类图/最小生成树的形式展现最小生成树的形式展现 多态性指数

11、：多态性指数：Simpsons index 16ppt课件 MLVA方法的应用方法的应用Neisseria meningitidis(23)Streptococcus pneumoniae(20),Streptococcus uberis(12),Salmonella Enteritidis(10),Salmonella enterica(5,35),Listeria monocytogenes(28,29,39),Legionella pneumophila(33),Clostridium perfringens(37),Leptospira interrogan(38,38),Escher

12、ichia coli O157:H7(30,46),Clostridium difficile(43),Burkholderia pseudomallei(42),Pseudomonas aeruginosa(32),Shigella spp(13)et.al.17ppt课件分型方法评价标准分型方法评价标准 区分度区分度(discriminatory power)数字化数据库数字化数据库 适合实验室间比对（适合实验室间比对（compare between laboratories）重复性（重复性（Reproducible）流行病学相关性（流行病学相关性（epidemiological conc

13、ordance）方便快速（方便快速（convenience and rapidity）稳定性（稳定性（stability）容易解释（容易解释（easy to interpret）花费花费 技术难度技术难度18ppt课件MLVA方法的好处方法的好处 上述的优点上述的优点 具有弹性具有弹性 flexibility.不需要参考菌株作为参照不需要参考菌株作为参照19ppt课件第二部分第二部分发展一种新的发展一种新的MLVA方法方法20ppt课件基于序列的比较基于序列的比较 初筛初筛多态性多态性VNTR位点的位点的PCR鉴定和筛选鉴定和筛选 核酸测序核酸测序确定重复模式确定重复模式区分效能评价区分效能评

14、价系统测试筛选多态性系统测试筛选多态性VNTR得分大于得分大于70，拷贝数大于，拷贝数大于3，同源性大于，同源性大于75%选择出选择出114位点位点现实的模板扩筛选现实的模板扩筛选 33血清型和血清型和21个猪链球菌个猪链球菌2型型 36个电泳行为不同个电泳行为不同确认重复序列和重复单元数确认重复序列和重复单元数14个确定指标个确定指标9个指标的个指标的MLVA策略策略21ppt课件 TRF 软件软件（Tandem Repeats Finder software）:/minisatellites.u-psud.fr/串联重复的鉴定串联重复的鉴定匹配赋匹配赋2分分不匹配不匹配-3分分碱基缺失碱基

15、缺失-5分分最小报告分值最小报告分值50分分以猪链球菌为例：以猪链球菌为例：鉴定了鉴定了750,749,790,784测序菌株基因组串联重复位点的比较测序菌株基因组串联重复位点的比较菌株名称菌株名称血清型血清型来源来源ST 型型GZ12(CP000837)ST1P1/72(www.sanger.ac.uk)ST105ZYH332(NC_009442)ST798HAH122(NC_009443)ST7SC842ST722ppt课件串联重复的鉴定串联重复的鉴定23ppt课件串联重复的鉴定串联重复的鉴定IndicesPeriodSize CopyNumberConsensusSizePercentM

16、atchesPercentIndelsScoreACGTEntropy(0-2)1858865-1858900123.0127005236533251.791862974-1863158463.946784228222312401.891867321-1867363162.61670752252513341.9324ppt课件串联重复的鉴定串联重复的鉴定25ppt课件26ppt课件inserted a small segment泳道1234567891011121314菌号SC22NJ2598029801GZ189-1591P1/7R735ATCC4376511611HASS-73SC0610

17、01SC0623806GZ115161718192021222324LN1GX2CQ1GZ2SC17SC8443800324380026RC4716Gx40727ppt课件28ppt课件多种重复模式多种重复模式IndicesPeriodSize CopyNumberConsensusSizePercentMatchesPercentIndelsScoreACGTEntropy(0-2)217182-217298244.524611896271635211.94217182-217291158.114571877271735201.94217221-217313392.4399411712516

18、34231.95217185-217309129.712581487271634211.95TR229ppt课件第三部分第三部分MLVA方法在猪链球菌分型中的应用方法在猪链球菌分型中的应用30ppt课件猪链球菌暴发疫情猪链球菌暴发疫情 2005年年-四川人感染猪四川人感染猪链球菌暴发疫情链球菌暴发疫情 215人感染、人感染、39人死亡人死亡 波及四川波及四川36个县的个县的202个村庄个村庄 重庆，重庆，贵州，贵州，广东，广东，江西也发现病例江西也发现病例 江苏江苏 1998暴发疫情暴发疫情 25 感染感染/14 死亡死亡Yu,H.,H.Jing,Z.Chen,et al.2006.Human

19、 Streptococcus suis outbreak,四川四川,China.Emerg.Infect.Dis.12:914-92031ppt课件中国猪链球菌PFGE型别 SmaI酶切：酶切：ST7型分为单一的型分为单一的PFGE-01型型 2005，2006年和年和2007年中国年中国ST7菌株：菌株：PFGE-01型型Ye,et al.2006.Emerg.Infect.Dis.32ppt课件codeLocusLocation in GZ1Matches In GZ1%Tandem repeat sequenceTmSimpsons index%TR1SSTR135_111bp_445_

20、3u135784.13622864CGTTAAGCAAATCCTAGACAAAATAGGAAATCGAAGCAGATAGCTTCAATCAAGGAGATTTATCTTTTTGCCAGAATTTGTAGCTCGAATTCAACTAAGATTAAGATAGAGGA604.7TR2SSTR218_39bp_210_2.7u218682.21889194AGCAGCCTGTAGTTGAGGCACCTGTAGAGGAAGTTGTAG588.2TR3SSTR1675_102bp_287_2u1675611.167589788CAAGAAAAAATGGTCCATTCTCGCCGTTGCGCCTTTCCAGT

21、TTCTTGGGCG605.9TR4SSTR1260_90bp_928_7u1259913.26084084ATATTGAAACCTCTGAAAAACAGATGCCAAGTATTGTGAACGACAATGTCGTAACACCTGAAAAGCAAATGGCTAATAAAGAGAACGATA558.3TR5SSTR69_49bp_352_2u69283.6963489AAGGTCCGGTGGACCTTTTTATCATGAGCATGAAAACAAGAAAGCGAATT605.9TR6SSTR928_30bp_172_2u927971.928142100CGTTGCTGGTACCGTAGCAGTTGC

22、ATCAGT607.0TR7SSTR127_10bp_134_4u127866.12799996AAAATATAGA587.1TR8SSTR260_231bp_677_2u260573.26124980CCAGAAGAGCCAAAACAAGACGCTCCACAAGCGCCATCAACACCGGAAAAACAAACAGAAGAACCGAACAAGGAAGAACCTAAGAAAACACCACAAGCGCCATCGACTCCGGAAAAACAACCAGAAGTACCGGAATCACCAAACCCAGAGACACCAGACGCGCCATCGACTCCAAAAGATGAACCGCAAGCTCCATCAA

23、TCCCAGAAGAAAAACCAAAAGTA5522.7TR9SSTR709_5bp_354_38u709802.710155100GAGCA5896.1猪链球菌猪链球菌MLVA指标和特征指标和特征上游引物标记：上游引物标记：FAM/HEX/TAMRA.多重多重PCRsM1和和M2用毛细管电泳用毛细管电泳M3用普通电泳法用普通电泳法TR18 低或中等变异度指标低或中等变异度指标TR9 高变异度指标高变异度指标(value 0.96).33ppt课件指标的等位基因型34ppt课件166 株株猪链球菌血清猪链球菌血清2型型的的MLVA分型分型 35ppt课件36ppt课件37ppt课件2005年

24、江西猪链疫情的分析年江西猪链疫情的分析 冷库的搬运工：冷库的搬运工：JX1 冷库猪肉：冷库猪肉：Jxs1，Jxs2，Jxs3 共同的型别共同的型别MLVA31.江西病猪来源于江苏江西病猪来源于江苏 1998年的三株江苏菌株和年的三株江苏菌株和2005年的江苏菌年的江苏菌株也为株也为MLVA31型。型。38ppt课件输入性人感染猪链球菌分析输入性人感染猪链球菌分析 2009年4月，泰国籍。我们实验室鉴定，分离菌株（W2886）血清2型，ST1型。TR1TR2TR3TR4TR5TR6TR7TR8TR9W288630.427214223GZ132.727224238SC0613430.4272242

25、2607GZ230.427224236SC8432.72722413039ppt课件Cluster ICluster II猪链球菌猪链球菌血清二型血清二型种群关系种群关系40ppt课件中国流行株型别特征中国流行株型别特征 流行株：流行株：B组组 MLST7 PFGE-SmaI 01 在中国，ST1型属于散发菌株 MRP+SLY+EF-MRP+SLY+EF+MRP+SLY+EF+MRP-SLY-EF-41ppt课件分型可以判定强毒株和弱毒株分型可以判定强毒株和弱毒株Cluster Icluster IIMLSTST1 序列群序列群ST25病症病症侵袭性病症侵袭性病症肺、上呼吸道肺、上呼吸道已知毒

26、力的菌株已知毒力的菌株P1/7,31533,中国中国ST7菌株菌株（强毒株）（强毒株）TD10,89/1591（弱毒株）（弱毒株）毒力因子毒力因子MRP+,EF+,SLY+MRP-,EF-,SLY-分离地区分离地区中国中国 欧洲欧洲北美北美分型潜能分型潜能强毒株强毒株弱毒株弱毒株42ppt课件MLVA分型方法的应用范围分型方法的应用范围 MLVA方法适合猪链球菌大范围的监测。方法适合猪链球菌大范围的监测。暴发调查：暴发调查：感染来源和追踪感染途径感染来源和追踪感染途径 研究猪链球菌的种群关系研究猪链球菌的种群关系43ppt课件合作与进步合作与进步44ppt课件志贺菌种群聚类（有根树）志贺菌种群聚类（有根树）45ppt课件福氏志贺菌福氏志贺菌Fxb按分离省份的按分离省份的MST树树46ppt课件痢疾志贺菌的痢疾志贺菌的MLVA分型尝试分型尝试47ppt课件鲍氏志贺菌的鲍氏志贺菌的15个指标的分型尝试个指标的分型尝试48ppt课件