重组蛋白质表达、复性与纯化课件.ppt

1、 6.6.细胞代谢产物的富细胞代谢产物的富集集遗传背景清楚，基因工程操遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；类齐全，表达效率高；基本不分泌，易形成包含体基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰无加糖等修饰 分泌蛋白质能力强，一般有天然分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；立体结构；无加糖修饰功能，培养液中蛋白无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；的水解；质粒不稳定，尚无商品化的表达质粒不稳定，尚无商品化的表达载体载体乳酸菌乳酸菌 (Lactic

2、acid bacteria)(Lactic acid bacteria)沙 门 氏 菌沙 门 氏 菌 (S a l m o n e l l a S a l m o n e l l a typhimuriumtyphimurium)苏云金杆菌苏云金杆菌 (Bacillus Bacillus thuringiensisthuringiensis)可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达基因表达;糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高清多糖浓度高;商品化表

3、达体系：商品化表达体系：酿酒酵母酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiaeSaccharomyce cerevisiae）;毕氏酵母毕氏酵母 (Pichia pastoris);(Pichia pastoris);裂殖酵母裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombeSchizosaccharomyce pombe）可以病毒感染的型式在成虫中生产，可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜蛋白的表达，有加适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；糖修饰；糖链有所区别，表达量有限；糖链有所区别，表达量有限；作为药

4、物宿主细胞未被作为药物宿主细胞未被FDAFDA认可认可可进行分泌表达，有天然可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；体蛋白质完全一致；表达量不够高，培养成本表达量不够高，培养成本较高较高 植物可大面积种植，可以廉植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；价大规模生产；转基因植物制作费时，表达转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化表达量较难提高，分离纯化不方便不方便 分泌生产有天然立体结构和分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适高，分离纯化方便，

5、特别适合药用蛋白的生产；合药用蛋白的生产；转基因动物制作花费巨大，转基因动物制作花费巨大，实验周期长实验周期长 分泌生产有天然立体结构的分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方易贮存和运输，分离纯化方便；便；实验成本低，饲养费用低；实验成本低，饲养费用低；加糖方式可能与人有所不同加糖方式可能与人有所不同:工业酶生产工业酶生产:各种微生物各种微生物 T5 T5 启动子启动子IPTGIPTG诱导诱导 araara启动子启动子阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导帮助可溶化帮助可溶化帮助分泌到周质帮助分泌到周质可用亲和层析纯化可用亲和层析纯化纯化方便纯化方便

6、:先用先用 溶液处理溶液处理,然后然后 洗洗出出 TEV protease:TEV protease:ENLYFQENLYFQ G GHow to get to the bottom of the funnel?And,what is at the bottom?cis-trans PDI has been shown to catalyze reactivation of non-native proteins without disulfide bonds.This function is independent from the redox/isomerase function,as i

7、t has been shown to exist in vitro with several model substrates that do not contain disulfides in their native structure.Marcus Mayer et al.,BiP and PDI Cooperate in the Oxidative Folding ofAntibodies in Vitro,JBC Vol.275,No.38,2000Marcus Mayer et al.,BiP and PDI Cooperate in the Oxidative Folding

8、ofAntibodies in Vitro,JBC Vol.275,No.38,2000Proline isomerization is widely accepted to be one of the rate-determining steps in protein folding.The function of PPIis to accelerate the cis-trans isomerization process.Molecular Molecular ChaperonChaperonHCA IIHCA IIHCA II with PPlHCA II with PPlHCA II with PPl HCA II with PPl and CsAand CsAP202N mutant P202N mutant with PPIwith PPIP202N mutantP202N mutantReactivation was initiated by rapid dilution of 0.3 M GuHCl and a protein concentration of 0.025 mg/ml(0.83,uM).PPI:9.6M;CsA:25M