第20-高效液相色谱法课件.ppt

1、HPLC第一节第一节 概述概述 high performance liquid chromatography以气相色谱理论为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1经典经典LC：仅做为一种分离手段：仅做为一种分离手段 柱内径柱内径13cm，固定相粒径，固定相粒径100m 且不均匀且不均匀 常压输送流动相；分析周期长；常压输送流动相；分析周期长；柱效低（柱效低（H，n）；无法在线检测，灵敏度差）；无法在线检测，灵敏度差2HPLC：分离和分析：分离和分析 柱内径柱内径26mm，固定相粒径，固定相粒径

2、17%，硅胶失活载体，吸附的水固定液，分配色谱4出柱顺序：出柱顺序：硅胶极性较大，强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱硅胶极性较大，强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2固定相：载体固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 3正相色谱正相色谱固定液极性固定液极性 流动相极性（流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分适于分离极性组分4.反相色谱反相色谱

3、固定液极性固定液极性 8.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合破坏键合相与载体的结合 pH3.0 pH3.0 腐蚀柱子腐蚀柱子3）适用：）适用：弱酸、弱碱物质弱酸、弱碱物质 pH=37弱酸；弱酸；pH=78弱碱；两性化合物弱碱；两性化合物第四节第四节 固定相固定相一、固定相一、固定相要求：颗粒细、均匀、球形、耐高压要求：颗粒细、均匀、球形、耐高压 1.液液-固色谱固定相固色谱固定相 硅胶：薄壳型；无定形全多孔硅胶硅胶：薄壳型；无定形全多孔硅胶(YWG)；球形全多孔硅胶（球形全多孔硅胶（YQG）2.化学键合相：化学键合相：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体利用化学反应将固定液的官能团键合在

4、载体 表面，而构成化学键合相表面，而构成化学键合相 非极性键合相：十八烷基键合相（非极性键合相：十八烷基键合相（ODS或或C18）是最常用）是最常用 的非极性键合相。的非极性键合相。中等极性键合相中等极性键合相 极性键合相极性键合相正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱吸附色谱吸附色谱2022-12-3 第五节第五节 流动相（溶剂系统）流动相（溶剂系统）对流动相的要求：对流动相的要求：与固定相不发生化学反应。与固定相不发生化学反应。pH介于介于28范围内。范围内。对试样有适宜的溶解度。使对试样有适宜的溶解度。使k在在110范围内（可用范围内（可用范围）或范围）或25（最佳范围），（最佳范围），k小，

5、小，tR小；小；k大，大，tR大，峰宽变大；大，峰宽变大；与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。止波长小于检测波长的溶剂。纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇乙腈等乙腈等可以降低柱压，提高柱效。可以降低柱压，提高柱效。22114kknRuCAH流动相采用粘度小、低流速的匀的固定相：采用粒度小、填充均n12121212RRRRVVttkkKK温影响小）质和固定相性质（受柱：调整流动相种类、性0ttVVKVCVCWWkRmsmmssms小）的配比（受柱温影响较：调整流动相和固定相k（二）流动相的

6、极性和选择性（二）流动相的极性和选择性 流动相的极性（强度）流动相的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 流动相的选择性流动相的选择性不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同 吸附色谱：同经典吸附色谱：同经典LC，二元或三元的有机溶剂，粘度小，二元或三元的有机溶剂，粘度小正相色谱：同吸附色谱法正相色谱：同吸附色谱法反相色谱：水反相色谱：水-有机溶剂，粘度小，无有机溶剂，粘度小，无UV吸收吸收 常用水常用水-甲醇或水甲醇或水-乙

7、腈乙腈续前（三）洗脱方式（三）洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）类似类似GC的等温度洗脱的等温度洗脱 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）具有方法简便、重复性好、色谱柱易再生等优点。具有方法简便、重复性好、色谱柱易再生等优点。对于成分复杂的样品，往往不能兼顾某些性质相差很大组分对于成分复杂的样品，往往不能兼顾某些性质相差很大组分的分离要求的分离要求2）梯度洗脱：）梯度洗脱：类似类似GC的程序升温的程序升温 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例，即不断在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例，即不断改变其极性（两个泵

8、）改变其极性（两个泵）。适于分析极性差别较大的复杂组分适于分析极性差别较大的复杂组分 缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形；增加检测灵敏度缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形；增加检测灵敏度 有时引起基线漂移、重复性较差有时引起基线漂移、重复性较差2022-12-3峰的鉴别：峰的鉴别：1苯；苯；2氯苯；氯苯；3对二氯苯对二氯苯 41，2，3三氯苯；三氯苯；51，3，5三氯苯；三氯苯；61，2，4三氯苯；三氯苯；71，2，3，4四氯苯；四氯苯；81，2，4，5四氯苯；四氯苯；9五氯苯；五氯苯；10.六氯苯六氯苯 （a）梯度洗脱梯度洗脱两种洗脱方式的比较两种洗脱方式的比较（b）等度洗脱等度洗脱RB

9、PC流动相流动相极性越强，洗脱能力越弱，溶质的极性越强，洗脱能力越弱，溶质的k越大越大（1）溶剂种类：水）溶剂种类：水+甲醇、水甲醇、水+乙腈乙腈（2）溶剂比例：水的比例增加，使）溶剂比例：水的比例增加，使k增大增大（3）溶剂）溶剂pH：影响弱酸、弱减的离解：影响弱酸、弱减的离解 流动相的流动相的pH降低，弱酸降低，弱酸k增大，增大，tR增大；弱碱增大；弱碱k变小变小选择流动相时应注意的几个问题：选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂（色谱纯）作流动相，防止微量）尽量使用高纯度试剂（色谱纯）作流动相，防止微量 杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。杂质长期累积损坏色谱柱和使

10、检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在 柱中沉积。柱中沉积。一、输液系统一、输液系统 高压输液泵 恒压泵：流量精度不稳恒流泵（常用）：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵双泵：为了克服流量的脉动。有串联式和并联式输液泵应具备的性能：流量精度高且稳定 流量范围宽 能在高压下连续工作 液缸容积小 密封性能好，耐腐蚀 2022-12-3二、色谱柱和进样系统二、色谱柱和进样系统 进样器注射器进样阀（六通阀，不停泵

11、进样）、自动进样装置 色谱柱（column）由柱管（不锈钢管）和固定相组成 分析柱（直径46mm，柱长1030cm）、制备柱 柱效评价：色谱系统适应性试验 R1.5，n（符合规定），fs（0.951.05）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗（了解）2022-12-3三、检测器三、检测器 1、紫外检测器：适于吸收紫外光的物质 检测原理：朗伯比尔(Lambert-Beer)定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=Cl 特点：灵敏度较高（10-610-9 g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。

12、专属型、浓度型检测器续前 紫外检测器类型：1）固定波长检测器：254nm2）可变波长检测器：光源：氘灯（和钨灯），200400（800）nm，单色器，流通池（试样），光电管光路系统和紫外分光光度计相似 3）光电二极管阵列检测器(DAD)：在获得色谱图的同时，还可以获得个组分的光谱图。即获得三维光谱色谱图。用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量,判断峰纯度续前 2、荧光检测器：只能分析自身发光的物质 灵敏度高 3、示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低，温度要求严格 4、电化学检测器 5、化学发光2022-12-3第八节第八节 定性、定量分析方法（同定性、定量分析方法（同GC法）法

13、）一、定性分析方法一、定性分析方法 1.色谱鉴定法保留时间 2.化学鉴定法 3.色谱-光谱联用鉴定法 （1）非在线色谱光谱联用法 （2）色谱-光谱联用仪2022-12-3二、二、定量分析方法同GC（自己看）1.外标法：应用较为广泛 2.内标法：内标法分为工作曲线法、内标对比法等。内标对比法：不需知校正因子，又具有内标法的定量准确度 与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分析结果（含量）常用标示量表示：100%理论值（标示值）测定值）标示量（2022-12-3 内标对比法：不需知校正因子，又具有内标法的定量准确度与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分析结果（含量）常用标示量表示：(Ai/As)样品 (ms)样品 W 标示量%100%(Ai/As)对照 (ms)对照 m 式中：(ms)样品与(ms)对照分别是内标物在试样溶液及对照溶液中的量;W为平均片重(或丸重等);m 是取样量.主要内容 化学键合相色谱法的固定相、流动相化学键合相色谱法的固定相、流动相 化学键合相色谱法的分离条件化学键合相色谱法的分离条件 高效液相色谱中的速率理论高效液相色谱中的速率理论 高效液相色谱仪的结构高效液相色谱仪的结构 定量分析方法定量分析方法 紫外检测器紫外检测器