细胞全能性课件.ppt
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- 细胞 全能性 课件
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1、-*第二章 细胞全能性与形态发生第一节 细胞全能性及其表达第二节 器官发生第三节 体细胞胚胎发生-第一节 细胞全能性及其表达细胞全能性概述细胞全能性概述细胞脱分化细胞脱分化细胞再分化细胞再分化-细胞的全能性细胞的全能性-一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。细胞全能性的绝对性与相对性细胞全能性的绝对性与相对性:不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应;即使对于植物细胞而言,细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体;动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。一.细胞全能性概述-植物细胞按照分裂能力分为三类:第一类是始终保持分裂能力,从一个周期进入另一个周期的周
2、期细胞。如茎尖、根尖及形成层细胞;第二类是永久失去分裂能力的细胞,为终端分化细胞。如筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞;第三类是在通常情况下不分裂,但在受到外界刺激后可重新启动分裂的Go细胞。表皮细胞及各种薄壁细胞。-一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度,取决于它在自然部位上所处位置和生理状态。不不同同类类型型植植物物细细胞胞向向分分生生状状态态回回复复可可能能进进行行的的程程度度趋趋势势 营营养养生生长长中中心心 形形成成层层 薄薄壁壁细细胞胞 厚厚壁壁细细胞胞 退退化化细细胞胞 (引自Gautheret,1966)-植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱:营养生长中心 形成层
3、薄壁细胞 厚壁细胞(木质化细胞)特化细胞(筛管、导管细胞);根据细胞所处的组织不同从强到弱为:顶端分生组织 居间分生组织 侧生分生组织 薄壁组织(基本组织)厚角组织 输导组织 厚壁组织。-细胞全能性脱分化脱分化再分化再分化细胞分裂细胞分裂个体再生个体再生细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的,在大多数情况下,脱分化是细胞全能性表达的前体,再分化是细胞全能性表达的最终体现。-二.细 胞 脱 分 化细胞生理与结构变化细胞生理与结构变化细胞脱分化调控机理细胞脱分化调控机理细胞分裂与愈伤组织形成细胞分裂与愈伤组织形成-培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞
4、脱分化(dedifferentiation)。离体培养下,脱分化过程发生在第一次有丝分裂之前.静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。细胞脱分化过程中生理和结构变化细胞脱分化过程中生理和结构变化-薄壁细胞:细胞核较小,核位于细胞边缘,细胞中央有大的液泡,细胞体内核糖体密度较低,多聚核糖体数目较少,质体为分化程度较高的叶绿体、杂色体、白色体和淀粉体。脱分化细胞:细胞质显著变浓,大液泡消失,核体积增加并逐渐移位至细胞中央,细胞器增加。在这些变化中,液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。-细胞脱分化的调控机理 细胞周期对脱分化的调控细胞周期对脱分化的调控 激素诱导表
5、达基因与细胞脱分化激素诱导表达基因与细胞脱分化PSKPSK的发现及其对细胞脱分化的影响的发现及其对细胞脱分化的影响细胞脱分化与染色体解凝聚细胞脱分化与染色体解凝聚环境因素的作用环境因素的作用-1.1.损伤作用损伤作用-损伤细胞产生的自溶物质可能对损伤细胞产生的自溶物质可能对脱分化的早期诱导起作用。脱分化的早期诱导起作用。2 2光线光线-影响外植体最初的分裂影响外植体最初的分裂3.3.氧氧-有利于脱分化有利于脱分化-细胞脱分化调控的实质即是G0期细胞回复到分裂周期的调控过程 G1“限制点”G0期缺少外界生长信号或某些必需的营养成分细胞周期蛋白(cyclin)和依赖周期蛋白激酶(CDK-2001年
6、度的诺贝尔生理学及医学奖获得者,美国科学家Hartwell与英国科学家Hunt和Nurse的工作揭开了这一过程的调控机制。细胞周期蛋白(cyclin)和依赖周期蛋白激酶(CDK cyclin-dependent kinase)是两类主要的调控分子。细胞周期运行的动力主要来自CDK,其活性则主要通过cyclin调节和依赖周期蛋白抑制子(CKI cyclin-dependent kinase inhibitor)的负调节。-植物激素是离体培养中所必需的条件,因此与植物激素相关的基因表达被认为是启动细胞脱分化的关键。Takahashi等(1989)从一个叶肉原生质体cDNA文库中分离到一个2,4-D
7、诱导表达的基因,命名为par。par基因在细胞从G0期转入S期的早期启动中具有功能性作用。Kyo等克隆了一组花粉富含硫蛋白(pollen-abundant phosphoproteins)基因NtEPa,NtEPb,NtEPc。其中NtEPc的表达与花粉细胞脱分化转变为胚性细胞高度偶联,认为该基因参与花粉细胞培养中细胞脱分化的过程但不参与细胞进入分裂周期后的调控过程。-不同植物愈伤组织诱导对激素的需求不同,一般分为四不同植物愈伤组织诱导对激素的需求不同,一般分为四类:类:需生长素的需生长素的-菊芋的休眠块茎菊芋的休眠块茎需细胞分裂素的需细胞分裂素的-白芜菁的根白芜菁的根需生长素、细胞分裂素需生
8、长素、细胞分裂素-烟草的髓、胡萝卜根、马铃烟草的髓、胡萝卜根、马铃薯块茎薯块茎需复杂天然提取物需复杂天然提取物-范围较广。范围较广。-MatsubayashiMatsubayashi和和SakagamiSakagami(19961996)在石刁柏叶肉细胞低)在石刁柏叶肉细胞低密度悬浮培养系统中,首次分离到密度悬浮培养系统中,首次分离到2 2个促分裂肽个促分裂肽phytosulfokine-phytosulfokine-和和(PSK,PSK)(PSK,PSK),检测分析发检测分析发现,在同时有现,在同时有NAANAA和和BABA存在的条件下,第一次细胞分裂存在的条件下,第一次细胞分裂发生在培养发
9、生在培养9696小时,而培养小时,而培养4848小时即可检测到小时即可检测到PSKPSK,在培养基没有在培养基没有NAANAA和和BABA的培养细胞中,检测不到的培养细胞中,检测不到PSKPSK的的存在,同时细胞也停留在存在,同时细胞也停留在G0/G1G0/G1期而不能启动分裂,期而不能启动分裂,由由此推测,此推测,PSKPSK可能介导了与生长素和细胞分裂素密切可能介导了与生长素和细胞分裂素密切相关的信号传导途径相关的信号传导途径 -烟草叶肉细胞脱分化过程中染色体有2次解凝聚过程。第一次解凝聚发生在细胞壁酶解过程中 第二次解凝聚发生在原生质体在含有生长素和细胞分裂素的培养基中诱导培养36小时
10、第二次解凝聚对于细胞进入S期是十分重要的,发生二次解凝聚的细胞在培养72小时后即进入S期,在不含植物激素的培养基中细胞,染色体不发生第二次解凝聚,以后迅速死亡。第一次染色体解凝聚是细胞脱分化的转换过程,通过此过程细胞关闭分化状态,而第二次解凝聚则是有丝分裂周期衔接过程。-细胞脱分化与愈伤组织形成 细胞脱分化是细胞状态的改变,但成功的脱分化必然会导致细胞分裂,对于单个细胞而言,分化细胞启动分裂显然是发生在细胞完全脱分化之后-*脱分化与愈伤组织的形成在性质上是不能等同的,脱分化是细胞生理状态的改变,而形成愈伤组织是离体培养中的一个阶段。尽管细胞脱分化后进入细胞分裂的结果,在大多数情况下是形成愈伤组
11、织,但绝不是说所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织,许多试验表明,有些外植体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞进而形成体细胞胚。-愈伤组织内的细胞并不是均一未分化的,即同一愈伤组织内的细胞之间其状态存在一定差异,特别是在组织器官培养时,往往出现部分细胞不完全脱分化的现象,从而使其很容易再分化再生植株,这对培养来说无疑是十分有利的。-从外植体到形成愈伤组织可分为三个阶段:从外植体到形成愈伤组织可分为三个阶段:诱导期诱导期-静止细胞准备分裂,其长短各植物不一。诱导静止细胞准备分裂,其长短各植物不一。诱导期需高生长素和低细胞分裂素。期需高生长素和低细胞分裂素。分裂期(增殖期)分裂期(增殖期)-细胞
12、不断分裂,可进行继代培养,细胞不断分裂,可进行继代培养,保持细胞分裂保持细胞分裂分化期分化期-出现次生生长,愈伤组织长期不继代培养,分出现次生生长,愈伤组织长期不继代培养,分化是不可避免的。化是不可避免的。-三.细 胞 再 分 化 所谓细胞分化(Differentiation),是指导致细胞形成不同结构,引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态和机能,这是在时间上的分化;同一种细胞后代,由于所处的环境不同而可以有相异的形态和机能,这是在空间上的分化。-从分化的遗传控制角度讲,细胞分化是各个处于不同时空条件下的细胞,基因表达与修饰差异的反应,所以,分化也可
13、以说是相同基因型的细胞由于基因选择性表达所反应的各种不同的表现型。在离体条件下,当细胞脱分化以后,无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长进而才能再生个体,因此,通常把离体培养下的这一过程称为再分化(redifferentiation)。-染色体的反复复制 DNA的差异扩增 基因重排 基因表达产物及其调控与修饰是细胞分化的本质所在。越来越多的研究显示,细胞分化主要受基因在转录水平和转录后水平的调控,其中一些特异蛋白基因的表达调节在细胞分化过程中起到了重要作用 细胞分化中的基因组变化-极性(polarity)是植物细胞分化中的一个基本现象。所谓极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴
14、向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。在很多情况下,细胞的不均等分裂是是细胞极性建立的标志。极性与细胞分化极性与细胞分化-Fucus合子细胞不均等分裂及其早期发育(引自Bouget等,1998)极性建立与质膜离子通道的不对称分布和细胞周质微管重排有关-通常把离体培养中TE(TE tracheary elements)细胞的出现作为组织分化的标志 而极性的建立似乎又是维管发生的一个信号,极性建立后生长素按极性方向流动,导致TE细胞分化 由于TE细胞在分化过程中具有细胞壁加厚,原生质体自溶等容易观察的细胞特征,从而又为植物细胞分化研究提供了模式体系 TE的形成与细胞分化-百日草叶肉细胞向
15、TE细胞分化的主要调控过程(引自Fukuda,1997)-由百日草叶肉细胞分化形成的由百日草叶肉细胞分化形成的TETE细胞(引自细胞(引自Motose,2001Motose,2001)-百日草叶肉细胞向TE分化过程中的基因表达分析(引自Demura等,2002)-激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素,其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。此外,在有些试验中也显示,GA3、ABA、乙烯等也在细胞分化中起到一定调节作用。激素对细胞分化的调控作用-*在离体条件下,如果用生长素和细胞分裂素处理的顺序不同,其作用也不一样。如果先用生长素处理,后用细胞分
16、裂素处理,则有利于细胞分裂而不利于细胞分化;反之,则有利于细胞分化。如果两者同时处理,则可促使分化频率的提高。生长素与细胞分裂素在细胞分化中的协同调控作用。-除了生长素和细胞分裂素外,赤霉酸(GA)、乙烯(EL)、脱落酸(ABA)、油菜素内酯(BR)等植物激素在细胞分化中的作用也有报道。越来越多的研究显示,植物激素对细胞生长与分化的调控是一个复杂的级联调控过程,离体培养条件下,由于外植体细胞所处的生理状态不同以及内源激素水平的差异,试图寻找外源激素水平在分化中作用的共同模式可能是很困难的。-细胞脱分化和再分化是离体培养过程中细胞全能性表现的基本过程,了解这一过程的调控机理,最终是为再生个体奠定
17、基础。生物个体形成是通过形态发生(morphogenesis)实现的,建立在离体培养基础上的形态发生称之为体细胞形态发生(somatic morphogenesis)。体细胞形态发生过程及其调控机理是细胞工程学研究的核心内容。-*第二节 器官发生 植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团(愈伤组织)分化形成不定根(adventitious roots)、不定芽(adventitious shoots)等器官的过程。-器官发生方式器官发生方式器官发生过程器官发生过程起始材料起始材料 对器官分化对器官分化 的影响的影响 激素对器官激素对器官 分化的调控分化的调控光照对器官光照对器官分化的影响
18、分化的影响器官分化的器官分化的基因调控基因调控-先芽后根先芽后根 先根后芽先根后芽 根芽同步发生根芽同步发生 器官发生方式一般而言,先芽后根,如先根则抑制芽形成。一般而言,先芽后根,如先根则抑制芽形成。-经过愈伤组织的器官发生经过愈伤组织的器官发生不经过愈伤组织的器官发生不经过愈伤组织的器官发生器官发生过程-经过愈伤组织的器官发生过程愈伤组织形成愈伤组织形成 生长中心形成生长中心形成器官原基及器官形成器官原基及器官形成-愈伤组织形成愈伤组织形成-生长中心形成,生长中心形成,具有单向极性,具有单向极性,与胚状体不同与胚状体不同-芽形成芽形成-芽芽外外生生芽芽内内生生-不经过愈伤组织的器官发生 在
19、有些情况下,外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基,这一途径有两种情况:一是外植体中已存在器官原基,进一步培养即形成相应组织器官进而再生植株,如茎尖、根尖分生组织培养。另一种情况是外植体某些部位的细胞在重新分裂后,直接形成分生细胞团,然后由分生细胞团形成器官原基。这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体培养中具有重要的实践意义。-a.细 胞第 一 次平 周 分裂b.生长中心形成c.原初分生组织d.芽原基形成-外植体的类型母体植物的遗传基础起始材料对器官分化的影响-总体上说,被子植物比裸子植物容易培养,在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培养成
20、功的报道最多。通常情况下,自然繁殖以无性繁殖为主的植物在培养条件下也有较强的器官分化的能力 同种植物不同品种(基因型)的培养效果具有较大差异已是不争的事实。基因型对于培养反应的差异,器官分化能力的差异大于愈伤组织诱导的差异。-NoImageNoImage 外植体对诱导反应及其再生能力的影响体还现在生理状态上 来源于生长活跃或生长潜力大的组织、器官的细胞更有利于培养 对于多年生植物而言,以幼嫩组织为材料无论是诱导还是分化均较容易。一、二年生无性繁殖植物的取材则可塑性较大,但仍以自然繁殖器官为外植体更易成功。-外植体选取合理与否,不仅影响培养的难易,而且有时甚至影响分化的程度和器官类型。花芽花芽营
21、养芽,花芽营养芽,花芽营养芽营养芽Tran Thanh Van等等,1974-激素对器官发生的影响激素对器官发生的影响 离体培养下的器官分化在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。在众多的植物激素中,生长素与细胞分裂素是2类主要的植物激素,在离体器官分化调控中占有主导地位。GA3,PSK在器官分化中也具有一定调控作用。-生长素/细胞分裂素高 有利于根分化 生长素/细胞分裂素低 有利于芽分化 生长素与细胞分裂素必须协调使用才能再生正常个体(引自Pierik,1987)-离体培养中,外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激素的活性从而影响其培养效果。外源细胞分裂素被外植体吸收后,在细胞内被
22、修饰和转化形成活化形式和钝化形式。一般认为,细胞分裂素自由碱基形式是活性形式,而核苷形式为钝化形式。通过细胞分裂素氧化酶对侧链的修饰可能是植物组织细胞中降低细胞分裂素活性的主要机制,在烟草细胞培养中使用二氢玉米素比使用玉米素更为有效,可能与二氢玉米素核糖苷不是细胞分裂素氧化酶的底物有关。-生长素进入细胞后,一部分以游离状态存在,另一部分则与氨基酸结合形成生长素氨基酸复合体。与生长素结合的氨基酸主要为天门冬氨酸,也有谷氨酸。2,4-D、NAA、IAA是常用的3种生长素。Ribnicky等(1996)的研究显示,由于生长素种类不同,形成生长素氨基酸复合体的量具有显著差异,从而亦表现出作为外源生长素
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