引物合成课件.ppt
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- 关 键 词:
- 引物 合成 课件
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1、引物合成金开瑞新一代基因合成开创者引物合成及常见问题解析引物合成介绍 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成,合成的方向是由待合成引物的3端向5端合成的,相邻的核苷酸通过35磷酸二酯键连接。DNA合成仪有很多种,但无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。我们公司目前用的是Dr.oligo192高通量引物合成仪。就具有合成质量稳定、一次性合成量大、时间短等优点引物合成过程 第一步是将预先连接在
2、固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5-羟基的保护基团DMT,获得游离的5-羟基;第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3端被活化,5-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5-羟基发生缩合反应。第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5-羟基上的
3、保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。目前引物的氨解一般都是通过氨水高温处理,将连接在CPG上的引物切下来,在经脱盐纯化得到成品。这种方法在纯化的过程中有可能会造成个别引物无法回收,而我们目前采用的是正丁胺氨解,在纯化时可以避免这个问题,不会经常因无法回收而使引物重合造成发货拖延的情况引物的纯化方式及选择一、RPC纯化 RPC纯化是通过反相净化滤芯(Reverse Phase Cartridge)对引物进行纯化,纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较,RPC是一种有效且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包
4、含一种疏水基质如 C18的硅胶,能够很好的吸附DNA,并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、PCR及基因合成等。国内主要是金斯瑞采用此类纯化方法。二、OPC纯化 采用寡核苷酸纯化柱(Oligonucleotide Purification Cartridge,OPC)纯化,制品纯度保证80 90%。此级别制品可用作PCR引物、DNA测序引物、等。该级别只提供长度在35 mer以下的合成DNA制品。序列更长时,制品的纯度得不到保证。目前华大、捷瑞使用该方法。引物的纯化方式及选择三、DSL纯化 又称为简易反相柱,对DNA有特异性吸
5、附,可被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱,因此能有效地去除盐分,但不能有效去除比目的片段短的小片段。该方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。目前金唯智使用该方法 其实以上三种方式都是脱盐纯化方式,都是可以有效的去除盐分,但不能去除短片段。下面介绍的两种纯化方式是目前常用的去除小片段的,不过目前客户需要的普通引物,脱盐纯化都可以满足客户的需求引物的纯化方式及选择四、PAGE纯化 PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,
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