细胞培养&2-组织培养设施和基本条件课件.pptx

1、第二章第二章组织培养设施和基本条件组织培养设施和基本条件实验室设计实验室设计原则原则 防止微生物污染和有害因素影响防止微生物污染和有害因素影响要求要求 工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘划分不同功能区或用铝合金板隔开划分不同功能区或用铝合金板隔开无菌操作区应在室内较少走动的内侧无菌操作区应在室内较少走动的内侧清洗和消毒安置在另室清洗和消毒安置在另室一般包括：一般包括：准备室、培养室和缓冲室准备室、培养室和缓冲室准备室：准备室：用于进行培养器皿的清洗、包装、培用于进行培养器皿的清洗、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等。养物质的准备和消毒以及供应物

2、品的保藏等。培养室：培养室：用于进行细胞培养和各种无菌操作的用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。其基本条件是：实验室。其基本条件是：清洁、无菌、干燥、清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。不通风，并具有适宜的光线。天花板不宜高过天花板不宜高过2.5M2.5M。缓冲室：（更衣室）缓冲室：（更衣室）专用培养实验室布局示意图专用培养实验室布局示意图普通细胞培养室内走廊普通细胞培养室内走廊宽敞的细胞培养区宽敞的细胞培养区（一）细胞培养室的设备（一）细胞培养室的设备超净工作台，CO2培养箱，倒置显微镜干燥箱，滤器，自动双重纯水蒸馏器，纯水仪，压力蒸汽消毒器离心机及天平冰箱，细胞冷冻存储器(液氮

3、容器或低温冰箱)常用培养器皿：培养瓶，培养皿，多孔培养板，吸管，加样器其它用品：离心管，冻存管，酸缸，烧杯，注射器，量筒等培养设备 超净工作台超净工作台(clean bench)利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气以微流方式徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。超净工作台结构和模式图超净工作台结构和模式图 生物安全柜生物安全柜保持台面整洁！物品在工作台中部洁净区围成新月状，物品在工作台中部洁净区围成新月状，酒精灯位于中央。酒精灯位于中央。东西要顺手东西要顺手左手上是左手取的东西：-吸管、培养瓶、试管架、废液缸等；右手上是右手操作物品：-dhanks、

4、培养基、胰酶以及瓶塞等渐少空气震动渐少空气震动操作步骤严禁存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不变；提前50 min开启紫外灯，30 min后关闭，开启超净工作台风机10 min，净化台内环境；打开工作灯达到工作照度；检查超净工台中准备的各种灭菌实验物品是否齐全；检查喷雾器喷洒效果及超净台内外擦抹用的药液是否已配置好；工作完毕，用0.1%新洁尔灭擦拭工作台面，关闭风机，打开紫外灯照射30 min，最后关闭电源。CO2培养箱培养箱nCO2培养箱设定的条件为培养箱设定的条件为37，5CO2，85%湿度。湿度。n使用使用CO2培养箱培养细胞时应注培养箱培养细胞时应注意的问题：意的问题：箱内物品不宜过

5、挤保持热空气畅通流动和箱内平均受热 箱内底板因接近电热器，不宜放置实验物品 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净，定期消毒。箱内水槽中加灭菌蒸馏水3 L以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。n水套式水套式n气套式气套式CO2供气凋节方法 调节CO2时必须与气瓶减压器联用。气瓶减压器有双表，左表是减压表，右表是高压表，高压表连接螺杆。减压器安装在CO2气瓶阀上，两者接头用扳手旋紧，胶管连接低压表出气口和CO2箱的进气口。打开CO2气瓶前，先按逆时针方向旋转减压器调节螺杆直到调节弹簧不受压力止。把CO2气瓶阀门缓慢打开，高压表指示瓶内气体量读数。按顺时针方向轻旋减压器调节

6、螺杆使CO2减压，当低压表直针指向0.04兆帕时，松动低压表的出口，使CO2气体缓慢流入箱内。若压力超过0.04兆帕，需再旋转螺杆，放出一部分气体后再调节。整个调节过程要细心、缓慢。若CO2不经减压直接进入箱内，可冲破培养箱的CO2调节装置（电磁阀）学生正在进行细胞观察学生正在进行细胞观察常用培养器皿常用培养器皿玻璃培养器皿为主，一次性培养器皿为辅。玻璃器皿玻璃器皿 玻璃瓶、培养瓶、培养皿、移液管和吸管、离心管、其它塑料器皿塑料器皿培养瓶、培养皿、多孔培养板、移液管、离心管、注射器、其它常用培养器皿培养器皿底面积(cm2)加液量(ml)可获细胞量96孔培养板0.320.110524孔培养板21

7、.0510512孔培养板4.52.01066孔培养板9.62.52.51054孔培养板285.07.01063.5 cm培养皿83.02.01066 cm培养皿215.05.21069 cm培养皿4910.012.210610 cm培养皿5510.013.710625cm塑料培养瓶255.05.010675cm塑料培养瓶7515-30210725cm玻璃培养瓶194.03.0106自动双重纯水蒸馏器自动双重纯水蒸馏器 纯水仪纯水仪用于烘干和干热消毒玻璃器皿用于烘干和干热消毒玻璃器皿(160 ，2 h)电热干燥箱电热干燥箱鼓风与升温同时进行，100度时可停止鼓风禁止先升温后鼓风100度以下时再打

8、开箱门物品不宜放置过挤，不利空气对流金属器械、塑料制品、橡胶等不能在干燥箱内消毒滤滤 器器Zeiss滤器：过滤除菌，大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌全自动手提式灭菌器全自动手提式灭菌器 使用注意事项使用注意事项 1）用前加水适量 2）待灭菌的物品放置不宜过紧；3）必须将冷空气充分排除；4）灭菌完毕后，不可放气减压；大容量高压蒸汽灭菌器大容量高压蒸汽灭菌器 高压蒸汽灭菌锅的使用方法高压蒸汽灭菌锅的使用方法 1）在外层锅内加适量的水，使水面与三角搁架相平为宜，将需要灭菌的物品放入内层锅，盖好锅盖并对称地扭紧螺旋。2）加热使锅内产生蒸气，当压力表指针达到 0.5个大气帕

9、时，打开排气阀，将冷空气排出，此时压力表指针下降，当指针下降至零时，即将排气阀关好。3）继续加热，锅内蒸气增加，压力表指针又上升，当锅内压力增加到所需压力（121）时，将火力减小，按所灭菌物品的特点，使蒸气压力维持所需压力一定时间（15-20min），然后将灭菌器断电，让其自然冷后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物。紫外灯：紫外线消毒。紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒台、塑料培养皿和培养板等表面消毒 移液器移液器移液器使用方法与注意事项1.设定移液体积设定移液体积 大量程调节至小量程；从小量程调节至大量程时，应先调至

10、超过设定体积刻度，再回调至设定体积。2.装配移液枪头装配移液枪头 将移液枪垂直插入吸头，左右旋转半圈，上紧即可。（不可撞击吸头！不可撞击吸头！）3.吸液及放液吸液及放液 垂直吸液：3mm以下；慢吸慢放；浓度和粘度大的液体：反向移液技术4.吸有液体的移液枪吸有液体的移液枪不应不应平放平放5.移液枪在每次实验后应将刻度应将刻度调至最大调至最大6.严禁严禁吸取吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体（浓酸、浓碱、有机物等）。7.严禁严禁使用移液器吹打混匀液体使用移液器吹打混匀液体。8.不要不要用大量程的移液器移取小体积的液体用大量程的移液器移取小体积的液体。9.如液体不小心进入活塞室应及时清除污染物如液体不小

11、心进入活塞室应及时清除污染物。细胞计数板细胞计数板酶标仪酶标仪 微孔板震荡器微孔板震荡器高速离心机高速离心机 超速离心机超速离心机 高速离心机使用注意事项1.高速离心机使用过程中一定要注意对称平衡2.高速离心机在超速离心时，液体一定要加满离心管，应超离时需抽真空，只有加满才能避免离心管变形。3.高速离心机离心管盖子密封性差液体就不能加满4.高速离心机使用角度头时别忘盖转头盖，如未盖，离心腔内会产生很大的涡流阻力和摩擦升温。液氮罐液氮罐液氮罐使用注意事项1.液氮是低温制品，在使用过程中要防止冻伤。2.在液氮中操作及存取冷冻物品时速度要快，要注意轻拿轻放，以免内容物解冻，造成不必要的损失。3.对于新罐或处于干燥状态的罐一定要缓慢填充并进行预冷。4.由于液氮不具杀菌性，故接触液氮的用具要注意消毒。5.液氮罐在运输过程中一定要固定好，以防震动和倒翻。冰箱普通冰箱是组织培养工作的必备设施培养液、消化液、缓冲液等都需要储存在4冰箱；血清、未用过的消化液和培养液则需冷冻保存在-20-70的低温冰箱中。冰箱内禁止存放易挥发、易燃和有毒的药品。定期清洁、保养，保持冰箱内清洁缩短开箱时间，延长冰箱寿命多人合用时，物品应分区摆放