大学精品课件：第十章 细胞核与染色体.ppt

1、2020/4/4,第十章 细胞核和染色体,中国药科大学药理教研室 胡梅,2020/4/4,1781年Trontana发现于鱼类细胞； 1831年，Brown发现于植物。 大小：1m500-600 m，一般低等植物14m，高等植物510m，动物510m。常以核质比来估算核的大小。正常细胞NP0.5，分裂期细胞NP0.5，衰老细胞NP0.5。 NP = Vn/（Vc-Vn）,2020/4/4,形状：圆形，胚乳细胞(网状）蝶类丝腺细胞(分支状)。 位置：细胞中央，成熟植物细胞中（边缘）。 数目：通常一个细胞一个核，成熟的筛管和红细胞（0）肝细胞、心肌细胞(1-2）破骨细胞(650）骨骼肌细胞(数百）

2、毡绒层(24)。 结构：核被膜、核仁、核基质、染色质、核纤层。 功能：遗传、发育。,2020/4/4,第一节 核被膜,Nuclear envelope,2020/4/4,核被膜是双层膜结构,构成：内核膜（inner nuclear membrane）外核膜（ outer nuclear membrane ） 核周隙（ perinuclearspace） 外核膜：面向胞质，表面附有大量核糖体，是内质网的一部分，。 核周隙：宽2040nm，与内质网腔相通。 内核膜：面向核质，表面光滑，没有核糖体颗粒，内表面的纤维网络叫核纤层，可支持核膜，并与染色质及核骨架相连。,2020/4/4,2020/4/4

3、,2020/4/4,核被膜的主要功能,核被膜使RNA转录和蛋白质合成在时间和空间上分开； 核被膜还能保护核内的DNA分子免受由于细胞骨架运动所产生的机械力的损伤； 通过核孔复合体进行物质交换与信息交流； 核被膜可合成生物大分子。,2020/4/4,核孔是物质运输的通道 核孔由至少50种不同的蛋白质（nucleoporin）构成，称为核孔复合体（nuclear pore complex，NPC）。 一般哺乳动物细胞平均有3000个核孔。 细胞核活动旺盛的细胞中核孔数目较多，反之较少。 在电镜下观察，核孔是呈圆形或八角形，现在一般认为其结构如fish-trap。,2020/4/4,核孔复合体结构模

4、型,横向：周边 核孔中心：环、辐、栓 纵向：胞质环、辐（+栓）、核质环,2020/4/4,核孔复合体结构模型（综合）,胞质环：外环，位于胞质面一侧，环上有8条短纤维对称分布伸向胞质； 核质环：内环，位于核质面一侧，环上也有8条对称的细长纤维，向核内伸入，纤维末端形成直径60nm小环，由8个颗粒构成捕鱼笼( fish-trap)或核篮 ( nuclear basket)； 辐：(spoke) 柱状亚单位(column subunit) 腔内亚单位(luminal subunit) 环带亚单位(annular subunit) 中心栓：(central plug),2020/4/4,2020/4/

5、4,抽提后核孔胞质面的,抽提后核孔胞质面的结构,抽提后核孔核质面的结构,2020/4/4,核孔复合体的功能,进行物质运输:包括主动运输和被动运输,2020/4/4,核孔运输特点,被动运输主动运输信号引导双向性,2020/4/4,通过核孔复合体物质运输的功能示意图 （引自B.Talcott等，1999）,A自由扩散 B协助扩散 C信号介导的核输入 D信号介导的核输出,2020/4/4,通过核孔的物质运输与信号序列有关,核定位信号（nuclear localization signal，NLS）：引导蛋白质进入细胞核的一段信号序列。受体为importin。 第一个被确定的NLS是病毒SV40的T抗

6、原，序列为：pro-pro-lys-lys-lys-Arg-Lys-val。 NLS对连接的蛋白质无特殊要求，完成输入后不被切除。 核输出信号（nuclear export signal, NES），引导RNP等输出细胞核，受体为exportin。 Ran蛋白，一类G蛋白，调节货物复合体的解体或形成。,2020/4/4,2020/4/4,亲核蛋白的入核转运,亲核蛋白通过NLS识别importin，与可溶性NLS受体importin / importin异二聚体结合，形成转运复合物； 在importin的介导下，转运复合物与核孔复合体的胞质纤维结合； 转运复合体通过改变构像的核孔复合体从胞质面被

7、转移到核质面；,2020/4/4,亲核蛋白的入核转运（二）,转运复合物在核质面与Ran-GTP结合，并导致复合物解离，亲核蛋白释放； 受体的亚基与结合的Ran返回胞质，在胞质内Ran-GTP水解形成Ran-GDP并与importin解离，Ran-GDP返回核内再转换成Ran-GTP状态。,2020/4/4,核输出,核蛋白体亚基和mRNA分子通过NPC输出也是具有高度选择性的信号指导过程，包含NES； 5端m7G帽子结构的功能对于mRNA及U1snRNA 的核输出是关键信号； mRNA前体hnRNP局限在细胞核内，必须经过剪切加工，与蛋白质结合后才被输出细胞核。,2020/4/4,非离子去垢剂溶

8、解膜结构系统,胞质中可溶性成分随之流失; 再用Tween40和脱氧胆酸钠处理,胞质中的微管、微丝与一些蛋白结构被溶去,胞质中只有中间纤维网能完好存留;然后用核酸酶与0.25mol/L硫酸铵处理,染色质中DNA、RNA和组蛋白被抽提, 最终核内呈现一个精细发达的核骨架网络, 结合非树脂包埋-去包埋剂电镜制样方法,可清晰地显示核骨架-核纤层-中间纤维结构体系。,核骨架形态结构 研究核骨架的分级抽提方法,2020/4/4,核纤层成分 核纤层蛋白(Lamin),哺乳动物和鸟类细胞中有 核纤层蛋白A 核纤层蛋白B 核纤层蛋白C,2020/4/4,核纤层蛋白的分子结构及 其与中间纤维蛋白的关系,核纤层与中

9、间纤维之间的共同点 两者均形成10nm纤维; 两者均能抵抗高盐和非离子去垢剂的抽提; 某些抗中间纤维蛋白的抗体能与核纤层发生交叉 反应 LaminA和LaminC的cDNA克隆推导出核纤层蛋白的氨基酸顺序与中间纤维蛋白高度保守的-螺旋区有很强的同源性, 说明核纤层蛋白是中间纤维蛋白。,2020/4/4,核纤层的作用：,1保持核的形态： 2参与染色质和核的组装：,2020/4/4,2 参与染色质和核的组装：核纤层在细胞分裂时呈现出周期性的变化，在间期核中，核纤层提供了染色质（异染色质）在核周边锚定的位点。在前期结束时，核纤层被磷酸化，核膜解体。其中B型核纤层蛋白则永久法尼基化(farnesyla

10、ted)，与核膜小泡保持结合状态,当核膜重现时,在染色体周围重装配, 形成子细胞的核纤层。,2020/4/4,A型核纤层蛋白在组装核纤层时通过蛋白水解失去C端(异戊二烯化,isoprenylation)。核膜崩解, 核纤层解聚时, A型核纤层蛋白以可溶性单体形式弥散到胞质中。 在分裂末期，核纤层蛋白去磷酸化重新组装，介导了核膜的重建。,2020/4/4,2020/4/4,第二节,染色质（chromatin),2020/4/4,1848年，Hofmeister从鸭跖草的小孢子母细胞中发现染色体。 1888年，Waldeyer正式定名为Chromosome。 1879年，W. Flemming提出

11、了染色质（chromatin）这一术语，用以描述染色后细胞核中强烈着色的细丝状物质。 后来的研究证明染色质和染色体是同一物质在不同细胞周期中的形态表现。,2020/4/4,染色质的主要化学组成,染色质由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成，比例为1：1：（0.6-1.5）：(0.05-0.1)。可见DNA与组蛋白的含量比较恒定，非组蛋白的含量变化较大，RNA含量最少。,2020/4/4,DNA是染色质中蕴藏遗传信息的生物大分子； RNA是染色质中含量很少的生物大分子； 蛋白质是参与染色质组织结构、DNA复制与转录调控的生物大分子:组蛋白、非组蛋白。,2020/4/4,染色质DNA,DNA在

12、染色质结构中，性质和数量是相对恒定的 基因组：在细胞内一套形态大小各不相同、协调工作的染色体（即单倍染色体组）及其上的全部基因,2020/4/4,基因组,现代遗传学家认为，基因是DNA(脱氧核糖核酸)分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。 基因组指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。说的更确切些，核基因组是单倍体细胞核内的全部 DNA分子；线粒体基因组则是一个线粒体所包含的全部DNA分子；叶绿体基因组则是一个叶绿体所包含的全部DNA分子。,2020/4/4,C值矛盾（C value paradox),基因组的大小通常以一个基因组中的DN

13、A含量来表示，称为生物体的C值。 从原核生物到真核生物，其基因组大小和DNA含量是随生物进化复杂程度的增加而稳步上升的；但在结构与功能相似的同一类生物中，以致亲缘关系很近的物种之间，其C值差异仍可达10倍乃至百倍。,2020/4/4,如人的 C值只有109bp，而肺鱼的C值则为1011bp。很难设想肺鱼的结构与功能比人类更复杂。,2020/4/4,C值的大小并不能完全说明生物进化的程度和遗传复杂性的高低，即C值和它进化复杂性之间并没有严格的对应关系，这种现象称C值矛盾或C值悖理（C value paradox)。 C值悖理表现在：1.一些物种之间的复杂性变化范围并不大，但C值却有很大的变化范围

14、，或者低级生物的C值较高级生物的C值还要大很多； 2.与预期的编码蛋白质的基因的数目相比，基因组DNA的含量过多，所以真核生物基因组中必然存在大量的不编码基因产物的DNA序列。,2020/4/4,生物基因组DNA,蛋白编码序列 编码rRNA、 tRNA、snRNA和组蛋白的串联重复序列 含有重复序列的DNA 未分类的间隔DNA,2020/4/4,基因组的高度重复序列,真核细胞中DNA的核苷酸除单一序列外、还含有高度重复序列，串状、首尾相连排列在一起，称串状重复序列。卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA是常见类型。,2020/4/4,卫星DNA（satellite DNA),卫星DNA，又称卫

15、星序列（satellite sequence)将真核生物基因组的DNA切成数百碱基对（bp)的片段进行CsCl密度梯度离心时，在主带的附近有一个次带相伴随，这是由于一些AT含量很高的简单重复序列所造成的。 有的高度重复序列DNA的碱基组成与总DNA的碱基组成差异不大，因而并非所有的重复序列都能成为卫星DNA，这种不能通过梯度离心而分析的重复序列，称隐蔽卫星DNA（cryptic satellite DNA)。,2020/4/4,卫星DNA特点,重复单位的碱基对数从510bp至100bp不等； 位于异染色质区，如着丝粒、端粒附近及Y染色体等； 拷贝数在生物群体内的变化较小，数目相对稳定； 功能不

16、明，推测与细胞分裂时染色体的运动及基因组的稳定性有关。,2020/4/4,小卫星DNA （minisatellite sequence),Weller发现人肌红蛋白基因第一内含子中存在33bp的串状重复，重复数为4； Jeffreys等将该重复序列克隆、酶切、标记后制成探针，与人基因组DNA进行Southern杂交，呈现多条杂交带。子女的每条带均可在其父母的图谱中找到，因而呈共显性遗传。,2020/4/4,小卫星DNA （minisatellite sequence）,将核心序列5-GAGGTGGGCAGGTGGA-3为探针检测基因组，得到与用33bp探针几乎相同的图谱。此即Jeffreys3

17、3.15探针； 所得杂交图谱具有极强的个体特异性，称“DNA指纹分析”，检测方法称“DNA指纹技术”。,2020/4/4,小卫星DNA特点,一般在12 100bp左右； 重复单位的拷贝数在群体内变异大； 分布于常染色质区。 序列的改变可影响邻近基因的表达。,2020/4/4,小卫星DNA用途,法医学上用于亲子鉴定及犯罪嫌疑人的认定，无关个体DNA指纹图相同的概率仅10-12； 农业上作为动植物品种的标志； 生物进化中用于分析物种间亲缘关系，确定分类地位； 育种工作中用于群体遗传纯度的检测、近交程度的估计、杂种优势的预测等。,2020/4/4,DNA fingerprinting depends

18、 on differences in length of minisatellite or microsatellite DNA,2020/4/4,微卫星序列 （microsatellite sequence),90年代以来，发现有些串状重复单位仅15bp，如（CA）n、（GT） n 、（GAA） n等，因重复单位比小卫星更短，称微卫星； 分布于常染色区； 拷贝数在个体间呈现高度变异，具高度多态性，成为不可缺少的分子遗传标记。,2020/4/4,微卫星DNA用途,基因作图 了解遗传病的发病机制，如脆性X综合征、肌强直性肌萎缩、亨廷顿式舞蹈症分别与（CGG）n (n200)、（CTG）n (n8

19、0)、（CAG）n (n42)的串状重复有关，拷贝数的异常增加导致疾病的产生。,2020/4/4,DNA的二级结构存在3种主要类型，即：B-DNA、Z-DNA、A-DNA,2020/4/4,组蛋白和非组蛋白,组蛋白是与DNA非特异性结合的蛋白 组蛋白是染色体的主要结构蛋白质 组蛋白分H1组蛋白，核小体组蛋白（H2A、H2B、H3、H4） 核小体组蛋白在进化过程中高度保守,非组蛋白是与特异DNA序列相结合的蛋白质 非组蛋白是维持染色体结构和催化酶促反应的蛋白质,2020/4/4,组蛋白和非组蛋白性质的异同点 （化学方面）,组蛋白带正电荷 富有精氨酸、赖氨酸 碱性蛋白质 不含色氨酸 能进行磷酸化作

20、用 在细胞质中合成 大都只能在S期合成,非组蛋白带负电荷 富有天门冬氨酸 、谷氨酸 酸性蛋白质 含有色氨酸 能进行磷酸化作用 在细胞质中合成 在整个细胞周期都能合成,2020/4/4,组蛋白和非组蛋白性质的异同点（功能方面）,组蛋白 在活动的与不活动的组织中含量相似 在活动的与不活动的染色质中含量相似 抑制依赖DNA的RNA合成 DNA合成的抑制物能制止它的合成 无种和组织的特异性 与DNA的连接无特异性,非组蛋白 活动的比不活动的组织含量多 活动的比不活动的染色质含量多 解除被组蛋白抑制的依赖DNA的RNA的合成 DNA合成的抑制物不能制止它的合成 有种和组织的特异性 与DNA的连接有特异性

21、即与特定基因连接在一起,2020/4/4,凝胶延滞实验 （gel retardation assay),1.制备一定长度和序列特异的DNA片段； 2.放射性标记，获得具有放射活性的序列特异的一段DNA； 3.待测细胞抽提物与标记DNA混合 迁移最快（未结合蛋白的自由DNA） 凝胶电泳 迁移慢（结合蛋白愈大，延滞越明显 ） 4 .放射性自显影 DNA带谱 相应结合蛋白 组分分离,2020/4/4,核心组蛋白高度保守的原因,可能有两个： 其一是核心组蛋白中绝大多数氨基酸都与DNA或其它组蛋白相互作用，可置换而不引起致命变异的氨基酸残基很少； 其二是在所有的生物中与组蛋白相互作用的DNA磷酸二脂骨架

22、都是一样的。,2020/4/4,二、核小体（nucleosome）,核小体的结构特点 Nucleosomeis basic structural unit of chromatin。 由200个左右bp DNA和四种组蛋白结合而成； 其中四种组蛋白(H2A、H2B、H3、H4 )各2分子组成八聚体的小圆盘，是核小体的核心结构； 146个bp的DNA绕在小圆盘外外面1 .75圈。H1与DNA结合, 起稳定核小体结构的作用； 两相邻核小体之间以连接DNA(linker DNA)相连, 长度为080bp不等。,2020/4/4,Evidence: (1)Electron micrographs of

23、 chromatin fibers,Isolated from interphase nucleus: 30nm thick,Chromatin unpacked, show the unclesome,2020/4/4,Evidence: (2)Nuclease digestion (Rat liver chromatin),2020/4/4,Gel electrophoresis after removal of chromatin proteins,Analyzed by electron microscopy,The basic repeat unit, containing an a

24、verage of 200bp of DNA associated with a protein particle, is the nucleosome,Evidence: (3)X-ray diffraction studies,2020/4/4,核小体,2020/4/4,组蛋白八聚体形成了双链DNA环绕的蛋白质核心,2020/4/4,2020/4/4,染色质包装层次,2020/4/4,染色体包装的骨架放射环结构模型,2020/4/4,染色体骨架放射环模型,2020/4/4,染色体“玫瑰花环”模型,2020/4/4,常染色质和异染色质,常染色质：间期核内染色质丝折叠压缩程度低，处于伸展状态，

25、用碱性染料染色时着色浅的染色质； 异染色质：间期核内染色质丝折叠压缩程度高，处于凝集状态，碱性染料染色时着色深的染色质。,2020/4/4,异染色质（核内深染部分）和常染色质（核内浅染部分）,2020/4/4,异染色质,结构异染色质（组成型异染色质）：由相对简单、高度重复的DNA序列构成，富含A-T，具有明显的遗传惰性，转录上无活性，DNA复制较晚，定位于着丝粒区、端粒、次缢痕及染色体臂的某些区段； 兼性异染色质：某些细胞类型或者在细胞的一定发育阶段，原来的常染色质凝集失去其基因转录活性，变为异染色质。随着细胞分化，较多基因依次以染色质凝集状态而关闭，染色质紧密包装、凝集，活化蛋白不能接近它，

26、丧失基因活性。,2020/4/4,巴氏小体,雌性哺乳类动物的X染色体就是一类特殊的兼性异染色质。在哺乳动物细胞内如有两个X染色体（通常为雌性），则其中的一个染色体常表现为异染色质，称巴氏小体（barr body）。人的胚胎发育到16天以后，一条X染色体转变为巴氏小体，呈块状紧靠核膜，染色反应表现为深染。因此通过检查羊水中胚胎细胞的巴氏小体可预测胎儿的性别。,2020/4/4,Main structures of chromosome,Centromere & Kinetochore,Centromere: Highly repeated DNA+Kinetochore,2020/4/4,染色体

27、的形态结构,2020/4/4,着丝粒的结构,着丝粒（centromere）和着丝点（kinetochore）是两个不同的概念，前者指中期染色单体相互联系在一起的特殊部位，后者指主缢痕处两个染色单体外侧与纺锤体微管连接的部位。 着丝粒包含3个结构域 1、着丝点结构域（kinetochore domain） 位于着丝粒的表面，包括三层板状结构和围绕外层的纤维冠(fibrous corona)。,2020/4/4,2、中央结构域 位于着丝粒结构域的下方。其中含有高度重复的卫星DNA。 3、配对结构域 位于着丝粒结构的内层，中期两条染色单体在此处相互连结。 对于着丝粒蛋白研究主要是使用ACA来研究的。

28、用ACAs发现鉴定出来的CENP主要有6种，即：CENP-A至F。,2020/4/4,染色体的数目,性细胞染色体为单倍体（haploid），用n表示; 体细胞为2倍体（diploid）以2n表示，还有一些物种的染色体成倍增加成为4n、6n、8n等，称为多倍体。 染色体的数目因物种而异， 如人类2n=46 ， 黑猩猩2n=48，果蝇2n=8，家蚕2n=56，小麦2n=42，水稻2n=24，洋葱2n=16.,2020/4/4,Human mitotic chromosomes and karyotype,A）染色体从细胞裂解出来的初始状态 B）人为地将染色体排队。,2020/4/4,核型与带型,1

29、. 核型：即细胞分裂中期染色体特征的总和。包括染色体的数目、大小和形态特征等方面。 2. 带型：染色体经物理、化学因素处理后，再进行分化染色，使其呈现特定的深浅不同带纹（band）的方法。 分带技术可分为两类： 一类是产生的染色带分布在整个染色体的长度上，如：Q、G和R带，另一类是局部性的显带，如C、Cd、T和N带。,2020/4/4,（水平线代表着丝粒位置） 人染色体带型,2020/4/4,人染色体带型（图解）,2020/4/4,染色体DNA的三种功能元件,一个DNA复制起点确保染色体在细胞周期中能够自我复制，维持染色体在细胞世代传递中的连续性； 一个着丝粒使细胞分裂时已完成复制的染色体能平

30、均分配到子细胞中； 两个端粒在染色体的两个末端必须要有端粒，保持染色体的独立性和稳定性。,2020/4/4,染色体的三种功能元件,2020/4/4,人造微小染色体 （artificial minichromosome),采用分子克隆技术把真核细胞染色体的复制起点、着丝粒和端粒三种DNA关键序列分别克隆成功，并把它们互相搭配或改造而构成。,2020/4/4,自主复制DNA序列（autonomously replicating DNA sequence,ARS),ARS具有一段1114bp的同源性很高的富含AT的共有序列，该序列及其上、下游各200bp左右的区域是维持ARS功能所必需的。如酵母菌染

31、色体的ARS是 5 200bp ATTTATATTTA 200bp 3,2020/4/4,Autonomously replicating sequences (ARS),ARS act as an origin of replication,2020/4/4,着丝粒DNA序列 （centromere DNA sequence,CEN),CEN序列的特点是有两个彼此相邻的核心区，一个是8090bp的AT区，另一个是11bp的保守区。一旦伤及这两个核心区序列，CEN即表现丧失其生物学功能。,2020/4/4,酵母菌染色体的CEN是,CEN ATAAGTCACATGAT 88bp(94%AT) T

32、GATTTCCGAA CEN ATAAGTCACATGAT 87bp(93%AT) TGATTTCCGAA,2020/4/4,端粒DNA序列 （telomere DNA sequence,TEL),酵母菌染色体的TEL是 染色体末端5 （CCACA）n 3着丝粒,2020/4/4,Tetrahymena,FISH (Human Probe ): TTAGGG,Anti-RAP1 antibody: Yeast cell,2020/4/4,第三节 端粒和端粒酶,一、端粒（telomere) 很早就发现，用x射线照射真核生物细胞时，能使染色体断裂，而断裂产生的染色体片段可以相互连接，但天然染色体末

33、端则不能与其他片段发生连接。这说明天然的染色体末端结构与内部不同，即有某种结构将染色体末端封住，使之不能与其他断裂片段相连接，这种结构称为端粒。,2020/4/4,端粒（1）,端粒是真核细胞染色体末端必不可少的结构，由蛋白质和DNA组成，大多数有机体的端粒DNA由非常短且数目精确的串联重复DNA排列而成，富含鸟嘌呤。功能是完成染色体末端的复制，使染色体免遭融合、重组和降解。从单细胞的有机体到高等的动植物，端粒的结构和功能都很保守。,2020/4/4,2020/4/4,端粒（2）,端粒的DNA序列多种多样，功能不需要独特的序列来维持。尽管在许多物种中端粒DNA有相当大的变化，但仍可在进化关系非常

34、远的生物中发现相同的端粒序列，所有脊椎动物、原生动物锥虫及几种粘菌和真菌都有相同的端粒序列T2AG3。而且 这条链比其互补链在3末端处多出1216个核苷酸，多出的核苷酸呈分子内简单折叠结构，以G=G配对方式连接，增加其稳定性。,2020/4/4,端粒（3）,端粒DNA的平均长度因物种而异，在人中大约15kb，在大鼠中可长达150kb，在小鼠中一般在580kb之间变化，而在尖毛虫中却只有20bp。在所有的有机体中，端粒DNA的长度总是波动变化的，酵母的端粒DNA在200bp到400bp间变化，随遗传或营养状态的改变而改变。四膜虫和锥虫等有机体的端粒长度在对数期会持续增加，相反，在人体中，随着细胞

35、的持续分裂，端粒会缓慢缩短。,2020/4/4,端粒（4）,端粒DNA常和非组蛋白结构蛋白质结合，但它不具有编码蛋白质的功能，结构蛋白可使端粒免受酶或化学试剂的降解，对染色体的稳定起着重要作用。当用x射线照射打断染色体末端时，会发生染色体片段缺失或末端融合等一系列行为。并引起疾病或肿瘤，现已发现在某些肿瘤中可见端粒融合现象。另外，结构蛋白对维持核的三维结构和控制基因表达及染色体行为都有重要作用。,2020/4/4,二、端粒酶（telomerase),1984年，Greider和Blackburn把合成的端粒与四膜虫细胞萃取物混合在一起时，这些端粒获得了附加的亚单位并得以延长，从而发现了端粒酶的

36、存在。同时，他们还发现如果萃取物中RNA变性，则此过程不能完成。 端粒酶是一种自身携带模板的反转录酶，在结构上是一种核糖核蛋白复合体，由RNA和蛋白质两种组分构成。自身携带有RNA组分作为复制时的模板是端粒酶区别于一般DNA聚合酶的主要特征。,2020/4/4,端粒酶（1）,编码人类端粒酶的RNA（hTR)的基因位于3号染色体长臂远端1/4， hTR有445个基本核苷酸，其模板区位于4656之间，为5CUAACCCUAAC3 ，与人类端粒重复序列（TTAGGG）n互补。 Antexier等又确定了hTR的最小功能区，是在44203个核苷酸之间，其中170199的hTR突变后活性几乎完全丧失，说

37、明这30个核苷酸为活性所必需，可能为端粒酶的蛋白质成分结合处。,2020/4/4,端粒酶（2）,端粒酶的RNA组分包括模板区及一些附加序列，模板区的序列与端粒重复序列互补。由于不同物种的端粒重复序列不尽相同，所以模板区序列的保守性较低。如四膜虫的模板区序列为5-CAACCCCAA-3 ，而人的模板区序列为5-CUAACCCUAAC-3 。模板区又可分为两个功能域：一个用作与端粒的末端结合定位，如四膜虫的模板区序列中5-CAA-3 部分，另一个用作为延伸复制的模板，如四膜虫的模板区序列中5-CAACCC-3 。延长的端粒DNA与端粒酶RNA模板解链重新互补定位，又可开始新的一组端粒重复序列的合成

38、，如此循环即可使端粒不断延长。,2020/4/4,端粒酶（3）,端粒酶RNA组分的一级结构的保守性是较低的，少者仅150个碱基，多者可达1300个碱基。但二级结构则相对保守性较高，存在有一些高度保守的附加结构。例如茎、假结和一些茎环样结构。 茎可能与二级结构的形成有关，而假结和一些茎环样结构可能用作与蛋白组分结合和参与端粒酶的装配。,2020/4/4,三、末端复制问题,在染色体线形DNA复制中存在的问题：已知的DNA复制都有RNA引物的参与，其势必占据后随链末端的一段DNA序列而使之无法复制；DNA连接酶的作用是连接两条紧邻的冈崎片段，必须是两条紧邻的DNA片段才能被其催化形成磷酸二酯键，显然

39、在后随链的末端是不具备这个条件的。这意味着在后随链末端的一段DNA序列最终未被复制，换句话说，每次所复制的子代DNA都将较其亲本DNA丢失一段末端DNA序列。这就是所谓的末端复制问题（End-replication-problem)。每次所丟失的DNA序列约50100bp。,2020/4/4,DNA复制 示意图,2020/4/4,末端复制问题（续1）,在后随链上，端粒酶辨认存在于端粒上G丰富的重复序列，以自身组分之一的、携带有合成重复序列的RNA作为模板，合成端粒重复序列新的拷贝，使它们从5 3延伸。然后，再以延伸序列作为模板，通过DNA聚合酶合成其互补序列。通过该作用机理，防止了复制过程中后

40、随链的渐进缩短。在后随链模板不断延伸情况下，保证了后随链合成的正常进行。通过端粒酶作用，弥补了端粒丢失，解决了“末端复制问题”，使细胞不会因端粒不断丢失而凋亡。,2020/4/4,端粒和端粒酶（图）,2020/4/4,端粒和端粒酶（图解）,A）外切核酸酶消化端粒5末端的RNA引物，留下单链DNA作为引物； B）端粒酶通过作为模板的RNA成分与端粒单链的其余部分结合； C）端粒酶的蛋白质部分使用RNA作为模板从DNA引物的3末端聚合脱氧核糖核苷酸； D）端粒酶沿DNA滑动，再一次把RNA模板暴露给其聚合酶活性部分； E）端粒酶的蛋白质成分再一次从DNA引物的3末端聚合脱氧核糖核苷酸。再一次，端粒

41、酶以其RNA作为模板。 F）端粒酶从延伸的单链DNA上解脱。延伸的ssDNA通过在鸟嘌呤之间形成非Watson-Crick碱基配对构成发卡样结构。结构末端的3-OH作为一个引物复制5末端。DNA修复酶弥补缺口，连接酶封闭余下的切口。,2020/4/4,端粒酶的作用,端粒酶的作用分三步： 端粒酶对已有的末端识别和结合； 根据端粒酶内含的RNA模板添加互补的核苷酸并聚合； 移位使端粒重复序列得以连续复制，对端粒DNA的富含G链进行加尾延长。,2020/4/4,末端复制问题（续2）,端粒核苷酸序列靠有模板的端粒酶来完成，正常体细胞缺乏此酶，故随着细胞分裂而变短，细胞随之衰老。但生殖细胞与此不同，可能

42、和保持其 不衰老有关。而转化的癌细胞出现端粒酶，可以在每次分裂后复制，保持端粒长度，从而维持细胞不死性。,2020/4/4,四、与衰老的关系,端粒假说：在体细胞中，端粒酶活性被抑制。因此，随着细胞不断分裂，端粒不断缩短，当达到一临界点时，可能触发某种信号，使细胞退出细胞周期并开始衰老（M1 stage crisis)，此即所谓的Hayflick界限。此时，若由于突变或病毒癌基因存在，阻止了细胞衰老，则细胞继续分裂，端粒进一步缩短，染色体不稳定性增加。因此，大部分细胞死亡（ M2 stage crisis），有极少数的细胞重新激活端粒酶，延长端粒而使染色体稳定。这些细胞可克隆扩增并变为永生细胞。

43、,2020/4/4,与衰老的关系（续）,端粒长度控制着衰老进程，端粒缩短是触发衰老的分子钟。在大多数正常的人体细胞中并不能检测到端粒酶的活性，端粒随细胞分裂每次丢失50100bp，这是由于正常的人体细胞中端粒酶未被活化，导致了端粒DNA缩短的缘故。当几千个碱基的端粒DNA丢失后，细胞就停止分裂而衰老。Bodnar等将人的端粒酶基因导入正常的细胞中，使得端粒酶异常表达。活化的端粒酶导致端粒序列异常延长，细胞旺盛增殖，细胞寿命大大延长，这为端粒钟学说提供了直接的证据。,2020/4/4,与肿瘤的关系,在正常的人体细胞中，端粒程序性地缩短限制了转化细胞的生长能力，这可能是肿瘤形成的一个抑制机制。端粒

44、酶的重新表达在细胞和永生化及癌变过程中起着重要的作用。有人甚至认为表达端粒酶的正常细胞更易癌变。人们在代表不同肿瘤类型的大约1000个活检样品中发现大约85%的样品呈端粒酶阳性反应。相反，90%以上的邻近正常组织却是端粒酶阴性。从而将这个酶与永生化和肿瘤的形成密切联系在一起。许多人认为端粒酶的激活是细胞癌变的重要一步。,2020/4/4,与肿瘤的关系（续1）,肿瘤细胞中端粒的长度有赖于端粒缩短及端粒酶激活后端粒延长之间的平衡。许多肿瘤细胞端粒较其起源组织的端粒短。已发现乳腺癌、白血病、肺癌等恶性肿瘤细胞端粒缩短的程度同恶性程度相关，端粒越短，恶性程度越高，似乎端粒缩短是恶变的原因之一。 由于端

45、粒酶特异地表达于各种肿瘤细胞，并且是大多数肿瘤细胞持续分裂所必需的，故抑制端粒酶的活性也许能够成为一种治疗肿瘤的新方法。,2020/4/4,与肿瘤的关系（续2）,抑制端粒酶法的优势： 大部分正常体细胞中无端粒酶活性，而肿瘤细胞中端粒酶活性水平很高，所以，端粒酶抑制剂具有较高的特异性和较少的副作用； 由于大多数肿瘤都具有端粒酶活性，因此端粒酶抑制剂可对大多数肿瘤起作用，具有广谱性； 传统疗法通常对早期肿瘤最有效，而端粒酶抑制剂有可能对晚期和扩散肿瘤也有效。,2020/4/4,与肿瘤的关系（续3）,端粒酶抑制剂应用的问题： 人体内生殖细胞、具有干细胞的更新组织和免疫系统也具有端粒酶活性，端粒酶抑制

46、剂对这些组织可能会产生不利影响。但有人认为由于多数肿瘤患者都已过生殖年龄，这在某种程度上克服了对生殖细胞损害的问题；而干细胞在大部分时间内都是静止的，因此端粒酶抑制剂也不会对它们产生很大影响。 约有10的肿瘤发生不需端粒酶激活，故有一些肿瘤对端粒酶抑制剂不敏感。 即使在有端粒酶活性的肿瘤细胞中，也可能存在其他的调节端粒长度的途径。,2020/4/4,第四节 核仁（nucleolus),核仁是真核细胞间期核中最明显的结构，通常是匀质的球体，一般12个，但也有多个的。核仁的形状、大小和数目因生物种类、细胞的形态和生理状况而变化，在蛋白质合成旺盛的卵母细胞和分泌细胞中，核仁很大，而在蛋白质合成不活跃

47、的肌肉细胞和精子细胞中核仁很小或无。 核仁又是一个在细胞周期中高度动态的结构，即在有丝分裂期间表现出周期性的消失与重建。,2020/4/4,核仁（续1）,核仁对细胞的生命活动具有重要意义，它是细胞核内rRNA转录、加工并组装成核糖体亚基的功能结构区域。生长旺盛的高等真核生物，每个细胞世代估计需要合成107个各种类型的rRNA，以构建107个核糖体。核仁rRNA基因可以高效地转录出如此大量的rRNA，这些rRNA分子可在核仁内与来自细胞质的核糖体蛋白质迅速地装配成核糖体亚基，然后转运到细胞质中。,2020/4/4,核仁（续2）,核仁的周期性出现与一些特殊染色体上存在的、含有rRNA基因的核仁组织

48、区密切相关。核仁组织区一般定位在核仁染色体次缢痕部位，这种具有核仁组织区的染色体被称为核仁染色体，它的数目依不同细胞种类而异，对人来说，有13、14、15、21、22五对染色体上存在NOR。核仁就是由NOR延伸的DNA环形成的。理论上人体细胞应形成10个核仁，但实际通常仅见12个，这是因为小的核仁往往迅速生长后相互融合，形成一个较大的核仁。,2020/4/4,2020/4/4,核仁的超微结构,核仁超微结构特点：没有被膜包裹、具核仁周期、在细胞分裂期核仁解体、在间期重新装配。电镜下，包括： 1、被致密纤维包围着的纤维中心（FC） 2、由致密细纤维构成的致密纤维组分（DFC） 3、由核糖核蛋白组成

49、的颗粒组分（GC）,2020/4/4,核仁结构,2020/4/4,纤维中心（fibrillar centers,FC),纤维中心是被致密纤维组分不同程度地包围着一个或几个低电子密度的圆形结构区域。FC实际上主要是由数条染色体上伸出的DNA袢环组成的，这些DNA是编码rRNA的基因，即rDNA，有人认为这些DNA处于无转录活性状态。,2020/4/4,致密纤维组分 （dense fibrillar component,DFC),致密纤维组分是电镜下观察核仁超微结构中电子密度最高的部分。染色深，呈环形或半月状包围FC，由410nm致密的细纤维构成，通常看不到颗粒物质，是rDNA活跃地进行rRNA合成的区域。,2020/4/4,颗粒组分 （granular component,GC),颗粒组分分布在密集纤维组分的外侧直到核仁边缘，是由电子密度较