《动物病毒学实验》课件：实验一-病毒在鸡胚中的培养.ppt

1、动物病毒学实验动物病毒学实验病毒学实验要求病毒学实验要求 做好生物防护做好生物防护1.白大褂白大褂+手套手套+口罩口罩2.所有实验废弃物集中处理，不能随意丢弃所有实验废弃物集中处理，不能随意丢弃 无菌操作无菌操作1.实验过程尽量不要说话，以免唾液污染实验材料实验过程尽量不要说话，以免唾液污染实验材料2.酒精灯使用：长时间不使用请熄灭酒精灯，长头发女生酒精灯使用：长时间不使用请熄灭酒精灯，长头发女生或男生请扎辫子或男生请扎辫子实验一实验一 鸡胚接种鸡胚接种病毒培养的宿主系统：病毒培养的宿主系统：本动物本动物 实验动物：家兔、小实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠白鼠、大白鼠、豚鼠 鸡胚鸡胚 组织

2、细胞组织细胞是否有血丝？怎么辨别公鸡母鸡？怎么辨别公鸡母鸡？什么是鸡胚？（受精什么是鸡胚？（受精 还是未受精）还是未受精）鸡胚如何生产？鸡胚如何生产？如何判断鸡胚是活的？如何判断鸡胚是活的？二、实验目的二、实验目的 了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用的鸡了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用的鸡胚接种方法。胚接种方法。一、原理一、原理 鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。组织和液体中含大量病毒。三、鸡胚的结构与功能三、鸡胚的结构与功能卵

3、壳卵壳壳膜壳膜气室气室绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜 尿囊腔尿囊腔羊膜与羊膜腔羊膜与羊膜腔卵黄卵黄卵白卵白卵壳卵壳壳膜壳膜上有细孔，进行气体交换上有细孔，进行气体交换使气体分子和液体分子在内外两方使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。面进行交换。气室气室 绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜呼吸和调节压力呼吸和调节压力起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。尿囊腔尿囊腔 胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中尿酸盐迅速

4、增加，胚胎发育到第中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-1312-13天后，尿囊液开始变混浊。天后，尿囊液开始变混浊。羊膜与羊膜腔羊膜与羊膜腔卵黄卵黄 卵白卵白其中盛有羊水，胎体浸泡于其中其中盛有羊水，胎体浸泡于其中在胚胎发育早期供给鸡胚营养。在胚胎发育早期供给鸡胚营养。在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。四、材料四、材料1.1.鸡胚鸡胚 1010日龄日龄2.2.病毒病毒 鸡新城疫病毒（鸡新城疫病毒（NDVNDV）3.3.酒精棉球、碘酊棉球酒精棉球、碘酊棉球4.4.照蛋灯照蛋灯5.5.打孔器打孔器6.6.石蜡石蜡7.7.注射器注射器8.8.蛋座蛋座十二指肠出血性溃疡十二指肠出

5、血性溃疡腺胃乳头出血腺胃乳头出血小肠出血小肠出血产畸形蛋产畸形蛋五、受精卵的选择五、受精卵的选择最好是来自最好是来自SPFSPF鸡群，以降低母源抗体的影响鸡群，以降低母源抗体的影响受精卵的壳最好是白色的受精卵的壳最好是白色的受精卵必须新鲜，保存在受精卵必须新鲜，保存在5-205-20不要超过不要超过1010天，天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。六、孵育六、孵育温度：温度：37.5-38.537.5-38.5相对湿度：相对湿度：50%-60%50%-60%新鲜空气流通，特别是在孵化新鲜空气流通，特别是在孵化5-65-6天以后天以后翻卵：从孵育后第翻卵：从

6、孵育后第3 3天开始，每天翻卵一次。天开始，每天翻卵一次。七、检卵七、检卵自孵育后的第自孵育后的第4 4天开始检卵，每天一次。天开始检卵，每天一次。孵育孵育4-54-5日于检卵灯上检查鸡胚受精与否及日于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。发育情况。未受精卵：未受精卵：只见模糊的卵黄阴影，不只见模糊的卵黄阴影，不见血管和鸡胚痕迹见血管和鸡胚痕迹活胚：活胚：具有清晰的血管和鸡胚暗影，具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可见到胚动，但孵育较大鸡胚还可见到胚动，但孵育1414、1515天以后胚动不明显，甚至无胚动。天以后胚动不明显，甚至无胚动。死胚：死胚：血管昏暗模糊，没有胚动。血管昏暗模糊，没有胚动

7、。八、接种前处理八、接种前处理用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。对鸡胚进行消毒。对鸡胚进行消毒。九、鸡胚用于病毒培养的优缺点九、鸡胚用于病毒培养的优缺点组织分化程度低，病毒易于增殖组织分化程度低，病毒易于增殖可选择不同的日龄和接种途径可选择不同的日龄和接种途径感染病毒的组织和液体中含大量病毒感染病毒的组织和液体中含大量病毒容易采集和处理容易采集和处理来源充足来源充足设备和操作简便易行设备和操作简便易行（一）优点（一）优点（二）缺点（二）缺点胚内可能污染细菌和病毒胚内

8、可能污染细菌和病毒 沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒脊髓炎病毒母源抗体母源抗体许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针十、接种途径十、接种途径1.1.尿囊腔接种尿囊腔接种绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种卵黄囊接种卵黄囊接种眼球接种眼球接种羊膜腔接种羊膜腔接种 正粘病毒和副粘病毒正粘病毒和副粘病毒脑内接种脑内接种 狂犬病毒狂犬病毒静脉接种静脉接种 蓝舌病毒蓝舌病毒2.2.用碘酊和酒精消毒气室端用碘酊和酒精消毒气室端3.3.用钢锥在气室中央锥一小孔用钢锥在气室中央锥一小孔（一）卵黄囊接种法（一）卵黄囊接种法主要用

9、于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。次氏体等的分离和增殖。方法一：方法一：1.1.取取6-86-8日龄鸡胚，用检卵灯照视画出气室和日龄鸡胚，用检卵灯照视画出气室和胚胎位置后，垂直放置在卵座上胚胎位置后，垂直放置在卵座上(大头向上大头向上)4.4.用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小孔用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小孔垂直刺入垂直刺入3cm3cm，注入，注入0.1-0.5ml0.1-0.5ml病毒液。病毒液。5.5.用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，每天翻卵每天翻卵1-21-2次，次，2

10、4h24h内死亡者废弃。内死亡者废弃。4.4.用钢锥打一小孔，将针头刺入约用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm1.5cm，注入病毒液，注入病毒液0.1-0.5ml0.1-0.5ml5.5.用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，继续孵育，24h24h内死亡者废弃内死亡者废弃方法二：方法二：1.2.1.2.同方法一同方法一3.3.将卵横放在卵座上，胚胎位置将卵横放在卵座上，胚胎位置向下。在卵长径的向下。在卵长径的1/21/2处用碘处用碘酊和酒精消毒酊和酒精消毒（二）绒毛尿囊膜接种（二）绒毛尿囊膜接种 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离

11、和增殖。方法一：方法一：1.1.取取10-1210-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒日龄鸡胚，画出气室部，消毒2.2.在气室端的卵壳上开一在气室端的卵壳上开一1.51.51.5cm1.5cm的口的口3.3.用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜4.4.滴入接种物滴入接种物5.5.用胶布或透明胶纸封闭切口用胶布或透明胶纸封闭切口方法二：（要造人工气室）方法二：（要造人工气室）1.1.在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-3-4mm4mm的烤焦圈。的烤焦圈。2.2.用碘酊和酒精

12、消毒后，小心用刀尖撬起卵用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。壳，造成卵窗。3.3.在气室中央钻一小孔。在气室中央钻一小孔。4.4.用针尖挑破卵窗中心的壳用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于尿囊膜，滴加生理盐水于刺破处。刺破处。5.5.用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入水迅速渗入6.6.用用1ml1ml注射器滴注射器滴

13、2-32-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。滴接种物于绒毛尿囊膜上。7.7.用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用石蜡密封。石蜡密封。8.8.胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。（三）（三）尿囊腔接种尿囊腔接种 主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感病毒、新城疫病毒的分离和增殖。病毒、新城疫病毒的分离和增殖。1.1.选用选用10-1110-11日龄的鸡胚，画出气室和胚位日龄的鸡胚，画出气室和胚位2.2.在

14、气室接近胚体处用碘酊和酒精依次消毒在气室接近胚体处用碘酊和酒精依次消毒3.3.用钢锥穿一小孔用钢锥穿一小孔（右图哪种接种方式较好？）（右图哪种接种方式较好？）4.4.将注射器针头经小孔沿卵长轴方向插入将注射器针头经小孔沿卵长轴方向插入0.5-0.5-1.0cm1.0cm，注入，注入0.1-0.2ml0.1-0.2ml接种物接种物（插入部位的选择，（插入部位的选择，胚体、对面还是两侧？如果注射器打不起去说明什么？）胚体、对面还是两侧？如果注射器打不起去说明什么？）5.5.用石蜡封孔，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并用石蜡封孔，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并检卵一次，检卵一次，24h24h内死亡者废弃内

15、死亡者废弃十一、十一、NDVNDV接种鸡胚后对鸡胚的影响接种鸡胚后对鸡胚的影响 NDVNDV以尿囊腔接种于以尿囊腔接种于9-109-10日龄鸡胚，强毒株日龄鸡胚，强毒株在在30-60h30-60h死亡，弱毒株死亡，弱毒株3-6d3-6d死亡。死亡的鸡胚以死亡。死亡的鸡胚以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、足尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、足趾、翅膀出血尤为明显。趾、翅膀出血尤为明显。十二、收毒十二、收毒 收毒前将鸡胚直立放置于收毒前将鸡胚直立放置于44冰箱半小时以上，冻冰箱半小时以上，冻死胚胎，防止出血。死胚胎，防止出血。根据接种途径的不同，收获相应的材料根据接种途径的不同，收获

16、相应的材料1.1.绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜收获接种部位绒毛尿囊膜2.2.尿囊腔接种尿囊腔接种 收获尿囊液（收获尿囊液（5-8ml5-8ml）3.3.卵黄囊接种卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体收获卵黄囊或胚体4.4.羊膜腔接种羊膜腔接种 收获羊水（收获羊水（0.5-1ml0.5-1ml）十三、试验报告作业十三、试验报告作业1.1.用于病毒培养的系统主要有哪些？用于病毒培养的系统主要有哪些？2.2.常用的鸡胚接种方法有哪些常用的鸡胚接种方法有哪些?3.3.简要说明鸡胚的结构及各部分结构的功能。简要说明鸡胚的结构及各部分结构的功能。4.4.用鸡胚来进行病毒的培养要注意哪些问题

17、用鸡胚来进行病毒的培养要注意哪些问题?5.5.如何区分无精卵、死胚、活胚？为什么最好如何区分无精卵、死胚、活胚？为什么最好选用白壳蛋？选用白壳蛋？6.6.卵黄囊接种与尿囊腔接种所用鸡胚日龄各卵黄囊接种与尿囊腔接种所用鸡胚日龄各是多少？为什么两者不一样？是多少？为什么两者不一样？7.7.在鸡胚接种后为什么每天要检卵，且在鸡胚接种后为什么每天要检卵，且24h24h内内死亡的鸡胚要废弃？死亡的鸡胚要废弃？8.8.收毒之前为什么要将鸡胚在收毒之前为什么要将鸡胚在44放置一段时放置一段时间？间？9.9.病毒接种鸡胚的目的或用途是什么？病毒接种鸡胚的目的或用途是什么？实验报告撰写要求实验报告撰写要求（一）实验目的（一）实验目的（二）实验材料与步骤（二）实验材料与步骤（三）实验结果（三）实验结果（四）讨论与分析（四）讨论与分析每位同学都需要撰写试验报告，作为成每位同学都需要撰写试验报告，作为成绩的考核依据之一绩的考核依据之一实验室卫生实验室卫生 实验结果观察：周四下午3:50 走之前签到，不能代签 实验报告选择思考题中3题作答