大学精品课件：中药治疗消化系统疾病药效研究.ppt

1、中药治疗消化系统疾病 药效学研究,内容： 中药治疗消化性溃疡药效学研究 中药治疗肝胃不和症药效学研究 中药治疗肝炎药效学研究 中药治疗肝纤维化与肝硬化药效学研究 中药治疗胆囊炎与胆结石药效学研究 中药治疗泄泻药效学研究,中药治疗消化性溃疡药效学研究,消化性溃疡是临床常见的慢性病，属“胃脘痛“、“嘈杂“、“吞酸“范畴，多由脾胃虚弱，气滞血瘀，致使胃络损伤。故常用益胃健脾、活血化瘀、理气止痛、清泻肝热等法治之。,主要药效学研究,1、抗消化性溃疡试验 （1）急性胃溃疡实验 应激法 幽门结扎法 药物法 （2）慢性胃溃疡实验 醋酸法 幽门螺杆菌法,2、生化药理学试验 （1）胃液量和胃液酸度的测定 （2）

2、游离酸及总酸度测定 （3）胃蛋白酶活性测定 （4）胃粘液测定 （5）胃粘膜血流量测定 3、其它 （1）止血试验 （2）止痛试验,应激刺激,血管收缩,胃运动亢进,副交感神经-垂体-肾 上腺系统兴奋性,应激性溃疡,胃酸、胃蛋白酶和 胃泌素分泌,胃黏膜缺血、缺氧和抵抗力,交感神经兴奋性,应激性胃溃疡模型,造模机制,应激刺激有那些?,外伤 休克 感染 过冷、过热 心理创伤 饥饿 水浸 束缚,应激性胃溃疡模型,体重160180g Wistar大鼠，雌雄不限。 多用雌性。,大鼠束缚笼；恒温水浴装置。,应激性胃溃疡模型,实验动物,器 材,应激束缚笼,应激性胃溃疡模型,禁食（不禁水）24h，麻醉，将动物固定(

3、笼)。 待其清醒后垂直浸于1820的恒温水浴槽中，水面浸至剑突水平。 水浸泡7h后取出，处死动物，立即开腹检查。 胃的固定及处理。 用10倍解剖显微镜测量每一个黏膜损伤的长度。 给药方法 动物预先灌胃给予受试药4d，末次给药后1h进行水浸应激试验。水浸应激7h后处死动物，测量溃疡指数。,应激性胃溃疡模型,操作方法,水浸3h，胃黏膜即发生损伤； 78h胃黏膜可出现多发性、出血性糜烂小点； 20h胃黏膜病变相当严重，但溃疡改变不超过粘膜肌层，且以腺胃（含胃体和胃窦）为重。 应激性溃疡在腺胃部沿血管走行分布，表面覆盖凝血块，去除凝血后可见深褐色条索状溃疡。,应激性胃溃疡模型,结 果,以长度、宽度、点

4、数“记分”,以淤血和长度记分,溃疡程度的评定,1.溃疡指数：,应激性胃溃疡模型,模型组溃疡指数给药组溃疡指数 溃疡抑制百分率 100% 模型组溃疡指数,.根据溃疡指数推算：,发生溃疡的动物数 溃疡发生百分率 100% 实验动物数,应激性胃溃疡模型,溃疡程度的评定,1. 水浸应激性胃溃疡发生率可达100%，重复性较好。中枢抑制剂、抗胆碱药、制酸药对其有明显对抗作用。尽管胃病变与人类消化性溃疡不同，但由于方法简单，结果可靠，迄今仍是研究抗溃疡药物的常用模型。 2. 水温应保持恒定。 3. 动物禁食期间，如自食粪便会影响实验结果。,应激性胃溃疡模型,模型评价与注意事项,应激性胃溃疡模型,模型评价与注

5、意事项,4.应激束缚笼的大小应与动物匹配，松紧度合。 5.雌性大鼠更易引起应激性溃疡。 6.中药一般在应激前预防给药。,幽门结扎后，可刺激胃液分泌并使高酸度 胃液在胃中潴留，损伤胃黏膜造成胃溃疡。,成年大鼠，雄雌均可。,幽门结扎法胃溃疡模型,造模机制,实验动物,1.给药3天。实验前大鼠禁食(24h)不禁水。 2.自胸骨剑突下沿腹中线切开腹壁，切口约23cm。在左侧肋缘部位用手指轻轻上推暴露胃。 3.在胃幽门与十二指肠连接处用结扎线将幽门结扎，注意勿将邻近的其他器官、血管结扎。同时经十二指肠给予受试药。缝合腹壁切口，用纱布包扎切口。,幽门结扎法胃溃疡模型,操作方法,4. 幽门结扎后，停止供水供食

6、，术后18h处死大鼠，取胃固定、剖检。 5. 沿胃大弯剪开胃壁，洗净胃内容物，将胃壁展开，胃黏膜面向上用大头钉固定在蜡板上。 6. 用肉眼或放大镜观察胃黏膜面，记录每只动物产生的溃疡数、溃疡程度、溃疡面积（或溃疡指数）及病变的情况。,幽门结扎法胃溃疡模型,病变程度的评价1溃疡面积,通过溃疡中心量取的最大纵径和横径 S=（d1/2）（d2/2） 式中S为溃疡面积，d1为通过溃疡中心量取的最大纵径，d2为通过溃疡中心量取的最大横径。,幽门结扎法胃溃疡模型,病变程度的评价2溃疡指数,可计数前胃部溃疡面积，以其总和作为溃疡指数。,幽门结扎法胃溃疡模型,病变程度的评价3溃疡程度（Okabe法）,在解剖显

7、微镜下测量溃疡面积，将每只 鼠溃疡面积的总合分为5个等级作为溃疡指数： 溃疡面积(mm2)： 1-12 13-25 26-37 38-50 50mm2或穿孔 溃疡指数: 1级 2级 3级 4级 5级,幽门结扎法胃溃疡模型,模型组溃疡指数给药组溃疡指数 溃疡抑制百分率 100% 模型组溃疡指数,发生溃疡的动物数 溃疡发生百分率 100% 实验动物数,病变程度的评价3溃疡程度（Okabe法）,幽门结扎法胃溃疡模型,形成的溃疡主要发生在对胃液抵抗力较弱的前胃部，多为圆形或椭圆形。 但病变较表浅，属于胃黏膜急性出血性糜烂，与人类胃溃疡的典型病变差距较大。,结 果,幽门结扎法胃溃疡模型,1.该模型方法简

8、单，溃疡发生快，发生率达97%，主要用于观察药物对溃疡形成的预防作用。,幽门结扎法胃溃疡模型,模型评价与注意事项,2. 观察药物对溃疡的影响时，动物应预先给药或同时给药，若粗制剂可采用灌胃给药，应确认胃内已排空后方能结扎幽门。粗制剂可在幽门结扎的同时采用十二指肠内注入给药较好。,（3）药物诱发胃溃疡或粘膜损伤,乙醇 利血平 吲哚美辛,1.减少胃黏膜中前列腺素含量，降低胃黏膜血流量，减少胃粘液分泌，引起胃黏膜微循环障碍等，破坏胃黏膜屏障的完整性导致溃疡。 2.细胞内钙超载和细胞凋亡。,乙醇法致急性胃溃疡,造模机制,成年大鼠，性别不拘。,大鼠禁食24h，不禁水。最后1次给予受试 药后，灌服无水乙醇

9、1ml/只。1h后开腹取胃， 固定检查，以溃疡指数进行组间比较。,乙醇法致急性胃溃疡,实验动物,操作步骤,15min后即可造成明显的胃黏膜损伤，且时 间越长损伤越严重。损伤主要表现为粘膜 充血、水肿、细胞坏死，伴有糜烂、出血 及纵行的条索状出血坏死。,乙醇法致急性胃溃疡,结 果,可以胃黏膜损伤长度的总和作为溃疡指 数。也可参照下表进行评分，以评分总 和确定损伤程度。,粘膜损伤长度 1mm 12mm 23mm 34mm 评 分 1 2 3 4,乙醇法致急性胃溃疡,结 果,乙醇性胃溃疡的程度与乙醇的浓度成正比，一般乙醇浓度40以上可引起胃黏膜明显损伤，80以上时出现明显破溃、坏死。因此，制备胃溃疡

10、模型时多采用75以上浓度的乙醇或无水乙醇。 也可用盐酸-乙醇(50%乙醇-O.15mmolL盐酸)给大鼠灌胃(1ml/100mg)造成溃疡，称为酸乙醇性溃疡。,乙醇法致急性胃溃疡,注意事项,诱发溃疡的主要机制包括： 减弱肾上腺素能神经功能，迷走神经兴奋性相对增高，使胃酸分泌增加，胃平滑肌及血管平滑肌收缩增强； 耗竭中枢及外周神经以及其它组织的多巴胺，使“多巴胺细胞保护作用减弱”； 减少胃黏膜中NO的含量，减弱胃黏膜的抗损伤能力。,利血平法致急性胃溃疡,造模机制,利血平是外周交感神经阻滞药,体重160180g的Wistar大鼠，雄雌各半。,禁食不禁水24h后，灌胃给予受试药后1h, 方法1. 皮

11、下注射 10mg/kg体重利血平 方法2. 腹腔注射 5mg/kg体重利血平 18h后颈椎脱位处死动物，开腹取胃。 腺胃部溃疡计数方法同水浸应激法。,利血平法致急性胃溃疡,实验动物,操作方法,损伤主要发生在腺胃部，可呈条索状出 血点、瘀血斑或糜烂灶。,利血平法致急性胃溃疡,结 果,1.利血平的剂量不宜过大，否则动物容易死亡。 2.处死动物最佳取材时间可根据预试验结果确定。 3.该模型的稳定性与动物体质、禁食时间、利血平剂量、室温等因素有关，应尽量控制条件。 4.阳性药对照可以选用H2受体拮抗剂（灌胃） 雷尼替丁0.135 g/kg体重 西咪替丁（甲氰咪胍）1.0 g/kg体重,利血平法致急性胃

12、溃疡,注意事项,吲哚美辛，又名消炎痛，是一种非甾体抗炎药。大剂量吲哚美辛显著抑制环氧合酶活性，致使胃黏膜防御因素减弱而形成溃疡。 环氧合酶是花生四烯酸合成前列腺素的关键限速酶。环氧合酶受抑制，可使胃黏膜生理性前列腺素E合成减少。 前列腺素E通过增加粘液和碳酸氢盐分泌、促进粘膜血流增加、细胞保护等机制，在维持胃黏膜防御和修复功能中起重要作用。,造模机制,吲哚美辛致急性胃溃疡,吲哚美辛,环氧合酶,前列腺素E,体重160180 g大鼠，雌雄各半。,大鼠禁食不禁水24h，皮下注射吲哚美辛2030mg/kg体重；7h后处死动物，观察溃疡情况并测量溃疡指数。 阳性对照药可选雷尼替丁，灌胃给予。,实验动物,

13、操作方法,吲哚美辛致急性胃溃疡,溃疡主要位于腺胃部，表现为与长轴 平行的线状、点状瘀血点。,结 果,吲哚美辛致急性胃溃疡,本模型胃溃疡发生率高，重复性好，缺点是溃疡比较表浅。 胃损伤程度与动物体质、禁食时间、吲哚美辛剂量、给予后的时间等有关。 观察中药的抗溃疡效果应预先给药，给药后3060 min再给吲哚美辛。 可采用阿司匹林口服或腹腔注射（150 mg/kg体重）复制类似的胃溃疡模型。,模型评价与注意事项,吲哚美辛致急性胃溃疡,（2）慢性胃溃疡实验 醋酸烧灼型胃溃疡动物模型 幽门螺杆菌感染性胃溃疡模型,成年大鼠，体重180200g，性别不限。,醋酸诱发慢性胃溃疡,造模机制,实验动物,在大鼠胃

14、浆膜面浸渍或在浆膜下注射一定量的醋酸，由于醋酸的腐蚀作用使胃黏膜损伤而造成溃疡。,禁食不禁水24h，麻醉，开腹暴露胃。 醋酸浸蚀的两种方法： 1. 醋酸注射法 2. 醋酸浆膜面浸渍法,操作步骤,醋酸诱发慢性胃溃疡,慢性胃溃疡动物模型,操作步骤,1. 醋酸注射法,（1）用小号注射针在浆膜下注入30%醋酸0.03 ml，缓慢拔出针头，勿使醋酸溢出。用生 理盐水清洗胃壁创面，胃复位，关腹。 （2）术后24h给予受试药。每天1次，连续给予 10d。 （3）术后11天处死动物，取胃、固定、剖检。 （4）观察并测量溃疡面积。,慢性胃溃疡动物模型,操作步骤,2. 醋酸浆膜面浸渍法,（1）用直径5.5mm的圆

15、形滤纸片蘸满冰醋酸，贴在腺胃部前壁浆膜面30s，同法重复1次。 （2）以生理盐水冲洗掉冰醋酸，胃复位，关腹。,术后35天，可形成界限清楚的溃疡。溃疡一 般呈圆形、椭圆形或不规则形，中心凹陷，四周 微隆起，密布毛细血管。 一般术后第5日，溃疡形成最为严重，以后缓 慢愈合，但病变有反复。 已愈合的溃疡，周围稍有隆起，表面红润， 可见愈合的痕迹。,结 果,醋酸诱发慢性胃溃疡,Hp含有尿素酶，能迅速分解食物中尿素并产 生氨，氨和胃酸使局部pH值增高，使细菌不被 胃酸杀灭。 Hp分泌产生细胞毒素，引起细胞损伤，使细胞 空泡化，导致胃黏膜完整性破坏，从而形成胃炎及胃、十二指肠溃疡。,幽门螺杆菌胃溃疡,造模

16、机制,单纯给动物灌服一定量的Hp菌液，只能在感染动物的胃黏膜造成炎症反应，很少引起胃黏膜破损、溃疡。因此，多在动物胃溃疡模型的基础上，使动物感染Hp。 常用动物有小鼠、大鼠、沙土鼠等。,幽门螺杆菌胃溃疡,大鼠：先用热烙法复制胃溃疡，在此基础上灌胃给予Hp菌液。热烙法是在无菌剖腹后，以3mm粗的15W电烙铁加热至45左右，灼烙腺胃约5秒种后粘膜出现水肿，6小时后有明显出血。 沙土鼠：动物禁食禁水1 d，第2天灌胃给予50%乙醇0.3 ml。之后继续禁食禁水，第2天灌胃给予HP菌液上、下午各1次，隔日上午再灌胃给予菌液1次。,操作方法,幽门螺杆菌胃溃疡,Hp检查感染后第4、8、12、和24周感染率

17、均达100%。 胃黏膜肉眼观察 感染后第4、8周未见胃黏膜糜烂、出血和溃疡等病变。感染后第12、24周，约37%动物可见胃黏膜明显出血、慢性活动性胃炎及溃疡病变。 组织病理学检查 感染后第4周幽门的黏膜层出现少量炎症细胞浸润，黏膜下层血管扩张、充血，腺体萎缩，伴有上皮细胞变性、坏死。,结 果,幽门螺杆菌胃溃疡,总 结 1、实验性胃溃疡动物模型的制造方法很多，但不同方法引起的溃疡病变、病情和病程则各有特点。因此，应根据中药的作用特性，选择相应的动物模型，才能正确反映中药的作用。 2、在制造各种动物模型时，造型结果的成功与否，均直接受动物禁食情况，浸水或热烙温度，乙酸留置时间，诱发溃疡药物的剂量及

18、给药途径等条件的影响，故应严格掌握实验条件进行造型。 3、对要求禁食时间较长的动物，在禁食期间尽可能单笼饲养，应将笼子架起，使动物排使后不再接触粪便，以防止动物由于饥饿而相互吃毛和粪便影响造型结果。,中药治疗肝胃不和证药效学研究,肝胃不和是肝失疏泄，胃失和降，二脏制约失调而引起的消化功能紊乱，应以疏肝理气，升清降浊法治之。 原则：舒肝理气、升清降浊 肝胃不和常因植物神经功能失调，导致胃肠功能紊乱，出现脘胁胀闷、疼痛等证，因此试验设计应包括胃肠功能试验、镇痛解痉试验，若见于慢性胃炎胆囊炎等疾病，应进行抗炎试验。,主要药效学研究,1、胃功能试验 （1）胃运动试验法：应用小鼠、家兔、猫或狗，进行胃运

19、动试验，观察受试药物对动物胃运动的影响，从而了解胃的运动机能。 （2）胃排空试验法：应用小鼠进行胃排空试验，观察受试药物对动物胃排空作用的影响。 （3）胃液分析：应用大鼠进行胃液分析检测 胃液量及胃液酸度测定； 游离酸及总酸度测定； 胃蛋白酶活性测定。,2、肠运动功能试验 小肠推进运动试验：应用小鼠或大鼠进行肠内容物推进运动试验，观察受试药物对小肠推进运动的影响。,3、镇痛解痉试验：肝胃不和常出现脘胁胀闷、疼痛等症，具有舒肝解郁功用的中药新药常有镇痛作用，可用小鼠扭体试验及平滑肌解痉试验，观察受试药物的镇痛作用。 4、抗炎试验：肝胃不和证若见于慢性胃炎、胆囊炎等疾病，则应用大鼠或小鼠进行足跖肿

20、或棉球肉芽肿试验，观察受试药物的抗炎作用。 5、其他试验：根据病因、病机及主、次证等的不同，结合受试药物功能主治和作用特点，也可选做一些有针对性的药效学试验，如针对神经性呕吐及胃肠型神经官能症等疾病，也可进行一些神经系统方面的试验。,注意事项 肝胃不和引起消化功能紊乱，表现的症候是多方面的，因此应根据受试药物的作用性质及特点，选做有关试验，以便从多方面反应受试药物的药效。,中药治疗肝炎药效学研究,病毒性肝炎属于“胁痛“、“黄疸“。多由“肝郁气滞“、“肝胆湿热“所致“清热解毒“、“疏肝理气“、“祛瘀通络“等法为主要治疗原则。本原则也适用于急性、慢性、迁延性及慢性活动性肝炎等。,1、抗肝炎病毒试验

21、 体外抗乙型肝炎病毒试验：2215细胞株体外培养方法，观察受试药物对乙肝病毒的抑制程度和药效。,主要药效学研究,2、保肝降酶试验 （1）四氯化碳急性肝损伤模型。 （2）D-半乳糖胺急性肝损伤模型。 （3）刀豆蛋白A急性肝损伤模型。 （4）四氯化碳慢性肝损伤模型。,CCl4在肝内经还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和肝微粒体细胞色素P450混合功能氧化酶的作用，生成活泼的三氯甲基自由基（CCl3）和氯自由基（Cl3） 。 1.肝细胞氧化：自由基 + 细胞大分子共价结合脂质过氧化膜结构和功能完整性的破坏肝细胞损伤坏死 2.肝细胞死亡：三氯甲基自由基抑制细胞膜钙泵活性使Ca2+内流增加细胞

22、中毒死亡 3. 肝脏能量生成障碍：三氯甲基自由基 + 蛋白质共价键损害线粒体脂肪酸氧化受抑制（影响肝脏能量生成障碍）三酰甘油和脂肪酸在肝细胞内蓄积。,造模机制,CCl4急性肝损伤模型,常用实验动物CC l4致急性肝损伤所需剂量和用法,动物 (CCl4)剂量 用法 形成肝损伤 (ml/kg体重) 所需时间 0.5% 10 颈背部皮下注射1次 约24h 小鼠 0.1% 10 腹腔注射1次 约24h 0.2% 10 于1、4、7日各灌胃1次 末次后1224h 25% 5 皮下注射1次 18d 大鼠 25% 5 皮下注射2次,间隔4日 18d 15% 1 每隔3日灌胃1次，共3次 末次后16h 家兔

23、50% 0.5 皮下注射1次，共3次 47d 33% 1.5 隔日灌胃1次，共2次 7d,CCl4急性肝损伤模型,1. 根据所用CCl4剂量和时间的不同，肝脏的损伤程度不同； 2. 一般在给予CCl4后1624 h血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性升高，并能反映肝损伤的程度； 3. 形态学上表现为肝小叶中央区坏死和脂肪变性。,结 果,CCl4急性肝损伤模型,1CCl4肝损伤模型是最常用的急性肝损伤模型，造模方法简单，成功率高，重复性好，价格低廉。 2CCl4剂量不宜过大，以免造成动物中毒死亡。 3CCl4是无色澄清的有毒液体，难溶于水，一般用花生油、橄榄油、豆油

24、等植物油混合成所需浓度。,模型评价与注意事项,CCl4急性肝损伤模型,4用CCl4复制肝损伤模型的主要缺点是，不同动物个体肝损伤的程度差异较大。小鼠接受CCl4后肝脏病理学改变与血清ALT等生化指标改变的相关性不如大鼠好。 5CCl4可从呼吸道、皮肤吸收，对人体有毒性，注意防护。,模型评价与注意事项,CCl4急性肝损伤模型,D-半乳糖胺（肝细胞磷酸尿嘧啶核苷干扰剂）： D-半乳糖胺 + 磷酸尿苷磷酸尿苷-半乳糖胺复合物磷酸尿苷 核酸、糖蛋白、脂糖等物质的合成,造模机制,D-半乳糖胺急性肝损伤模型,一次性腹腔注射 500850 mg/kg体重 200400 mg/kg体重,操作方法,170250

25、gWisar大鼠,D-半乳糖胺急性肝损伤模型,224 h出现不同程度的肝损伤,剂量超过1000 mg/kg体重,常造成广泛性肝坏死或动物中毒死亡,一般于注射D-半乳糖胺后2436 h血清ALT、AST活性升高，血清胆红素总量增加，镜检可见肝细胞变性、坏死，组织化学显示肝细胞糖原和RNA减少，脂肪堆积。,结 果,170250gWisar大鼠,D-半乳糖胺急性肝损伤模型,1.D-半乳糖胺与CCl4所致肝损伤的组织学改变明显不同。CCl4损伤：肝小叶中央静脉周围区大量肝细胞坏死和出血，脂肪变性十分明显； D-半乳糖胺损伤：呈弥漫性、多发性片状坏死，脂肪变性不如CCl4明显，嗜酸性小体较多见，与人类病

26、毒性肝炎的肝损伤类似。,模型评价,D-半乳糖胺急性肝损伤模型,2.方法简便，成功率高，重复性好，肝脏病变具特异性。D-半乳糖胺肝损伤模型是目前公认的研究病毒性肝炎发病机制和药物治疗效果的较好模型。,模型评价,D-半乳糖胺急性肝损伤模型,刀豆蛋白Con A是一种植物蛋白，是可活化T细胞的丝裂原。 Con A进入小鼠体内后可引起与人类自身免疫性肝炎相似的肝损害。 与Con A诱发肝损害相关因素： 1.活化T淋巴细胞、巨噬细胞，促进细胞因子释放。如TNF-、IFN-、IL-2等与早期肝细胞损害关系密切。 2.其他如粘附分子、趋化因子、一氧化氮、肝细胞凋亡等也参与了Con A所致肝损伤的发病过程。,造

27、模机制,Con A急性肝损伤模型,小鼠尾静脉注射Con A(10或29mg/kg体重，0.3ml/只) 3 h后，即见血浆ALT、AST开始升高，8 h后升高明显，升高的趋势和速度与Con A剂量呈正相关。 当给予Con A剂量为20 mg/kg体重，2 h后肉眼可见肝脏淤血、变暗，并逐渐加重，8 h后逐渐减轻。 光镜下可见肝内大量T淋巴细胞浸润，肝窦内红细胞淤积。注射后8 h可见肝细胞核破裂和凋亡小体等，肝内有点状、片状肝细胞坏死，坏死区内见淋巴细胞浸润。,结 果,Con A急性肝损伤模型,本模型是由淋巴细胞介导的肝损害模型，很好地模拟了人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等疾病，是研究这些肝病发

28、病机制和治疗药物的较理想模型。 Con A所致肝损害，一次性尾静脉注射后2 h即可见肝细胞损害，8 h肝损害达高峰，制作快速、简便。 Con A致肝损害具有剂量依赖性，选用剂量0.1530 mg/kg体重时，肝损害程度随药物剂量加大而加重。当剂量达20 mg/kg体重以上时，8 h内出现小鼠死亡。 病变具有肝脏特异性，Con A静脉注射后8 h，组织病理学检查未发现肺、肾、脾、心等肝外器官损伤。,模型评价,Con A急性肝损伤模型,四氯化碳反复多次给药，易造成慢性肝中毒，致使肝细胞变性、坏死及纤维组织增生，甚至发生肝硬化。,造模机制,CCl4慢性肝损伤模型,每周皮下注射递增浓度的CCl4（剂量

29、为0.2 ml/kg）1次，浓度由低向高逐渐增加，依次为5%、10%、20%和30%，每23周递增一个浓度，连续3个月。 末次注射CCl4 48h后，测定血清ALT、AST活性、血清总蛋白、清蛋白含量。取出大鼠肝脏，称重，计算肝脏系数（g/100 g），并对肝脏进行组织病理学检查。,操作方法,130150雄性Wisar大鼠,CCl4慢性肝损伤模型,1所用CCl4浓度开始不宜过高，否则易引起动物死亡；CCl4浓度增加的速度可根据动物状态掌握，当大部分动物状态不佳并出现死亡时，不应增加浓度。 2采用颈背部皮下注射CCl4，个别动物可出现局部炎症和硬结，因此应每日更换注射部位。,注意事项,CCl4慢

30、性肝损伤模型,3、免疫功能试验 （1）迁慢性肝炎常与自身免疫有关，可用免疫性肝损伤模型进行保护试验。 （2）巨噬细胞吞噬功能及血清溶血素的测定。 （3）对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响：应用ConA诱导的小鼠脾细胞，观察受试药物对细胞免疫功能的影响。 （4）循环免疫复合物（CIC）总补体及C3，以及对肝特异性脂蛋白（LSP）及肝细胞膜抗原（LMAg）的自身免疫性反应等有关试验（本项试验可酌情选做）。,4、利胆试验 5、退黄试验：小鼠或大鼠，以异硫氰酸-1-萘酯5070mgkg口服，造成黄疸模型，观察受试药物的退黄作用。,中药治疗肝纤维化和肝硬化 药效学研究 中医认为瘀血阻滞肝脉是肝纤

31、维化的共同病理基础，并兼有脾气虚损、肝肾阴虚、气机郁滞、痰浊凝滞、热毒内蕴等。根据以上病理特点，中医一般采用活血化瘀、益气活血、滋阴活血、行气活血、解毒活血及化痰活血等六种治法。,肝纤维化,肝纤维化是指各种致肝脏损伤因素长期反复作用于肝脏，引起肝细胞变性、坏死和炎症，在修复过程中导致细胞外基质 ECM异常增多和过度沉积的病理过程。 肝纤维化的形成，主要是由于肝星状细胞激活，ECM成分生成过多，降解相对不足，胶原等ECM在肝内大量沉积所致。,肝纤维化与肝硬化的区别？,肝细胞弥漫性 变性、坏死,肝内纤维组织增生,肝细胞结节状再生,这三种 病变反 复交错 进行,肝内 血循环改建,假小叶 形成,肝 硬

32、 化,如果长期反复多次给予CCl4 ，可导致肝内纤维增生，逐渐形成肝硬化。,造模机制,CCl4肝纤维化肝硬化模型,1皮下注射40%50% CCl4植物油溶液，首次5 ml/kg体重，以后2 ml/kg体重，每周2次，共10周。动物自由饮水进食。 2制备肝脏组织石蜡切片，HE和胶原纤维染色，进行病理学检查。,操作方法,CCl4肝纤维化肝硬化模型,该模型较为可靠，复制时间较短，肝纤维化进展稳定，适合于肝纤维化发生、发展过程的动态观察和研究，是目前国内外常采用的动物模型。,模型评价,CCl4肝纤维化肝硬化模型,第2周：肝小叶中央区出现片状肝细胞变性坏死，未见明显纤维组织增生。 第4周：除肝细胞变性坏

33、死外，肝内开始形成较薄的纤维间隔。 第6周：肝脏纤维间隔进一步增厚，有假小叶形成。 第8周：肝组织正常结构破坏，形成厚的纤维间隔，并分割形成假小叶。实验中大鼠成活率在60%左右。,结 果,CCl4肝纤维化肝硬化模型,如果长期反复多次给予CCl4 ，可导致肝内纤维增生，逐渐形成肝硬化。,造模机制,CCl4肝纤维化肝硬化模型,1皮下注射40%50% CCl4植物油溶液，首次5 ml/kg体重，以后2 ml/kg体重，每周2次，共10周。动物自由饮水进食。 2制备肝脏组织石蜡切片，HE和胶原纤维染色，进行病理学检查。,操作方法,CCl4肝纤维化肝硬化模型,该模型较为可靠，复制时间较短，肝纤维化进展稳

34、定，适合于肝纤维化发生、发展过程的动态观察和研究，是目前国内外常采用的动物模型。,模型评价,CCl4肝纤维化肝硬化模型,采用皮下注射CCl4，喂饲玉米面、高脂、高胆固醇食物和饮用酒精等复合因素复制肝纤维化肝硬化模型。,造模机制,CCl4复合因素模型,CCl4复合因素模型,1. 大鼠体重下降。 2. 第2周时肝细胞变性、坏死，表现为小叶中心出现小片状肝细胞气球样变、脂肪变性、坏死和间质轻微炎症反应，镜下未见明显纤维增生。血清ALT、AST活性升高，血清清蛋白含量减少，肝脏羟脯氨酸含量增加。 3. 第4周为纤维增生改变，除肝细胞变性坏死外，肝内开始有纤维间隔形成。 4. 第6周时为假小叶形成改变，

35、肝脏纤维间隔进一步增宽，肝组织正常结构被破坏，有假小叶形成，导致肝硬化。,结 果,CCl4复合因素模型,1CCl4加高胆固醇和酒精饮食所致大鼠肝纤维化， 是目前国内外常采用的动物模型。该模型可靠， 复制时间较短，肝纤维化进展稳定，适合于肝纤 维化、肝硬化发生发展过程的动态研究，是值得 应用的一种模型。 2如果动物体重较前一次下降30%以上，可停止注 射CCl4 1次，以减少动物死亡率。,模型评价,CCl4复合因素模型,1.形态学观察：可使用各种胶原纤维染色，并可做图象分析。,2.血清胶原代谢指标检测：,前胶原（PCIII）及其氨基端肽（PIIIP）、 纤维连接蛋白（FN）、 透明质酸（HA）。

36、,检测指标,CCl4复合因素模型,细胞色素P450是肝微粒体内最重要的药物代谢酶 类，苯巴比妥肝药酶诱导剂，引起肝实质肿大和内质 网增生。苯巴比妥能增加细胞色素P450的活性，加速 CCl4向三氯甲基自由基转化，从而增加CCl4的肝毒性， 加速肝纤维化形成，可缩短造模周期。,造模机制,苯巴比妥加速CCl4模型,体重100150g Wistar大鼠。,大鼠饮用38mg/100ml苯巴比妥2周，待肝脏显著 肿大后，以CCl4原液灌胃，开始剂量为0.02ml/100g 体重，每5天给予1次，以后按体重调整CCl4用量。,实验动物,操作步骤,苯巴比妥加速CCl4模型,给予CCl4后810周形成小结节型

37、肝硬化，死亡率 在 40%左右；1620周可复制肝硬化腹水模型， 腹水成功率高达92.7% ，但动物死亡率较高，有 时达52.9%。,结 果,苯巴比妥加速CCl4模型,1.CCl4加苯巴比妥能加速肝纤维化形成，缩短实验周期，是目前制备CCl4肝纤维化动物模型的较好方法。 2.动物死亡率较高。,模型评价,苯巴比妥加速CCl4模型,中药治疗胆囊炎、胆石症药效学研究,急性胆囊炎、胆石症属于“黄疸“、“胁痛“等证范畴，一般表现为上腹剧痛，发烧、恶心、呕吐或黄疸等症状，急则治其标，根据病因，病机、病情、辩证施治，以达治疗之目的。,概念 结石,基本类型： 色素性胆石-呈泥沙样及砂粒状；成分以胆红素为 主，

38、含少量胆固醇。 胆固醇性结石-黄色或黄白色，表面光滑，剖面呈放射状。常为单个，体积较大，欧美多见。 混合性胆石-呈多种颜色，我国最多见，结石多为多面体。大小数目不等。,胆结石,胆管结石 胆囊结石,色素性胆石,胆固醇性结石,混合性胆石,依据人类胆石形成的主要诱发因素，如 胆汁理化状态的改变、胆汁淤滞、胆道感 染、胆道异物、代谢因素等，采用单一或复 合因素造模。,胆石病模型,主要药效学研究,一、食饵性胆色素结石模型,胆色素结石易发生于高碳水化合物膳食的人群，与正常人相比患者胆汁的磷脂明显增高。给豚鼠喂饲低蛋白饲料造成肝脏及胆汁中-葡萄糖醛酸酶活性增高，促使结合胆红素水解为游离胆红素，与钙离子结合形

39、成不溶于水的胆红素钙盐，形成结石。,胆石病模型,发病机制,豚鼠每日喂饲含2%酪蛋白、2%猪油、2%纤维素、3%蔗糖、0.04%胆酸及0.1%胆固醇饲料。,一、食饵性胆色素结石模型,胆石病模型,操作方法,健康成年豚鼠,结 果,于喂养1.53个月胆囊内形成团块或凝块结石。 胆石呈褐黄色或淡黄色，胆汁混浊且色深。,饲料配方中的胆酸和胆固醇是形成结石的关键。 用体重350450 g雄性豚鼠，用含50%淀粉、15%葡萄糖、35%标准饲料喂养20 d，造模成功率达94%。 用体重140160 g地鼠，用含70%蔗糖、8.5%酪蛋白、5%麻油、5%混合盐、10%微晶纤维素、1%复合维生素和0.5%氯化胆碱的

40、饲料喂养6周，造模成功率为80%。,一、食饵性胆色素结石模型,胆石病模型,注意事项,二、感染性胆色素结石模型,感染性胆色素结石的发病与胆道感染及胆汁瘀积有明显关系。感染是生石的首要因素，瘀积是生石的必要条件。,胆石病模型,用一定量大肠杆菌注入胆总管引起感染时，大肠杆菌产生-葡萄糖醛酸酶，可使水溶性胆红素水解为游离胆红素，后者与钙结合形成不溶性胆红素钙，在粘液物质的凝聚下形成胆色素结石而析出，加之胆总管被结扎，胆道阻塞，导致细菌繁殖加快并促使感染加重，可加速胆色素结石的形成。,胆石病模型,造模机制,胆石病模型,造模机制,感染,胆色素结石,胆道阻塞,向胆总管内注射0.1ml大肠杆菌菌液（1.510

41、6/ml）,近肝门处结扎胆总管,（38周后）,将人的同类型结石或蛔虫碎片或其他异物直接植入兔或犬的胆囊内，以此为核心，23个月后可诱发大量胆色素结石。脱落的胆道上皮细胞、细菌残体、蛔虫碎片、蛔虫卵等均可作为结石的核心，使之不断增大。,三、异物植入性胆色素结石模型,胆石病模型,造模机制,被植入的结石应来自同一个人，并预先消毒、烘干至恒重，每只动物植入结石的重量、大小应一致，以备实验前后称重及测量比较。 可做胆汁成分分析，并以此将动物均匀分组。 手术时应尽量减少对胆囊组织的刺激，以免影响实验结果。,三、异物植入性胆色素结石模型,胆石病模型,注意事项,四、体外溶石试验,在模拟生理环境下，利用药液与胆

42、石直接接触，观察药物对胆石的溶解作用。,溶石原理,胆石病模型,操作方法,胆石标本制备 取人的胆固醇或胆色素结石各1份，若干块。每类胆石需取自同一病例的多发结石，选择大小、形状相似和表面完整者，摄片、分析成分确定其类型，经烘干恒重后记录重量。 溶石试验 将各类胆石分别置于细孔尼龙网袋内，浸入盛有受试药物（溶石液）的磨口带塞试管中，室温静置，每日或间隔一定时间更换溶石液。记录溶液中有无碎石，并测定溶液中胆固醇、胆红素和钙的含量，以胆石消失的时间和重量变化等为判断指标。,胆石病模型,2、抗炎试验 （1）小鼠耳廊肿胀法、足跖肿胀法、棉球肉芽肿法进行抗炎试验，观察受试药物的抗炎作用。 （2）毛细血管通透

43、性试验：小鼠或大鼠，致炎后进行毛细血管通透性试验，观察受试药物对急性炎症的影响。 （3）白细胞游走试验：大鼠或小鼠，致炎后，观察受试药物对炎性渗出液中白细胞游走及血浆蛋白的影响。,3、止痛试验：可用镇痛试验及或平滑肌解痉试验观察受试药物的止痛作用。 4、解热试验：可用家兔或大鼠，制备各种致热动物模型（如用内毒素、酵母、菌苗、药物等），观察受试药物的解热作用。 5、利胆试验：可用大鼠或家兔进行胆汁流量的测定，观察受试药物的利胆作用。 6、抑菌试验： 7、其他试验：必要时可作及红、白细胞数、白细胞分类，尿素氮、尿胆素、胆红素、胆固醇及转氨酶等指标。,利胆实验,原理：大鼠无胆囊，其肝脏分泌胆汁经胆总

44、管直接进入十二指肠，从胆总管收集胆汁流量最能反应肝脏分泌胆汁能力，不受胆囊储存胆汁的干扰，客观的测定药物对肝脏分泌胆汁的影响。,胆管插管方法,胆管插管方法,将麻醉大鼠仰位固定于手术板,沿腹白线用粗剪刀剖开腹腔23cm,沿十二指肠降部肠系膜找到白色透明具有韧性的胆总管,在接近十二指肠开口处，向肝脏方向剪“V”形口,将胆汁引流管插入胆总管，引出腹壁，结扎固定,胆汁流量增加百分率（） （给药组-对照组）胆汁流量（ml） 对照组胆汁流量（ml）,100%,中药治疗泄泻药效学研究,泄泻可分为寒湿、湿热、食滞、脾虚等证，临床表现为大便次数增多，溏便、清稀甚至水样便。治疗此证常以健脾渗湿，和胃除湿及消食导滞

45、为主。,主要药效学研究,1、止泻试验 常用小鼠，以药用蓖麻油、大黄粉或番泻叶等诱发小鼠腹泻，以在一定时间内各组动物排出的湿粪总粒数、重量或同时记录排湿粪动物数等为指标，观察受试药物的止泻作用。,腹泻动物模型,腹泻类型： 渗出性腹泻 由肠道炎症、溃疡、肿瘤浸润等引起的肠道粘膜完整 性破坏，造成大量渗出而引起。 渗透性腹泻 常见原因为消化不良、吸收不良和肠系膜淋巴管梗 阻，使肠腔内渗透压升高。 分泌性腹泻 由于胃肠道的水和电解质分泌过多。,常用腹泻模型: 番泻叶、大黄诱发大肠性腹泻。 蓖麻油诱发小肠性腹泻。 多数研究同时采用两种腹泻模型，便于了解止泻药物的作用部位。,腹泻动物模型,一、蓖麻油致腹泻

46、模型,造模原理,腹泻动物模型,致泻时间：26h,实验动物,成年小鼠，体重1822g。,操作方法,1.小鼠禁食4h，每只灌服蓖麻油0.20.3ml，小鼠置于笼底垫有滤纸（或白色吸水纸）的单养笼内。观察一定时间内小鼠排出烂便及稀便的点数。 2.在观察受试药物的止泻作用时，可预先给予受试药物一定时间后再灌服蓖麻油，也可先给蓖麻油再给受试药物。给予受试药物的观察时间一般为610h。,腹泻动物模型,注意事项,动物的周龄和体重应基本一致，试验前应观察动 物粪便12d，有腹泻者弃去不用。 2. 如果拟观察药物的止泻作用，应根据给药途径的 不同而决定动物是否需要禁食。 3. 所用笼底钢筛的网眼不能太密，应利于

47、粪便漏到 滤纸上。,腹泻动物模型,二、大黄致腹泻模型,造模原理,大黄致泻的主要成分是蒽醌苷类。大黄口服后，大黄蒽醌苷部分被小肠吸收，在体内还原为蒽酚，再由结肠分泌至肠腔，刺激结肠，使其蠕动增加而致泻。未吸收的大黄进入大肠后，其中所含的番泻苷A由细菌分解未番泻苷元，也能使大肠蠕动增加。,腹泻动物模型,致泻时间：68h,实验动物,体重1822g 小鼠。,操作方法,1.小鼠禁食46h，每只灌胃100%大黄水提液1ml。小鼠置于笼底垫有滤纸（或白色吸水纸）的单养笼内。观察一定时间内小鼠排出烂便及稀便的点数。 2.采用大黄连续灌胃造成亚急性腹泻模型，一般造模510d，停止造模后给药治疗35d。,腹泻动物

48、模型,注意事项,1.大黄的致泻机制基本清楚，造模成功率高，致泻较缓和。本模型的稳定性不如蓖麻油，但由于取材方便，方法简单，也是目前国内应用较多的一种模型。 2.造模的关键因素是大黄制剂，其质量、煎煮时间、给药剂量等都会影响模型的稳定性。 3.如果采用连续多天造模，大黄的剂量不宜过大，以免引发继发性便秘。,腹泻动物模型,三、番泻叶致腹泻模型,造模原理,番泻叶的致泻成分主要是番泻苷A和B，可刺激大肠，使其蠕动增加而引起腹泻。,实验动物,体重1822g 小鼠。,腹泻动物模型,操作方法,1.番泻叶混悬液的制备 取干燥的番泻叶片研磨成细末，加沸水研和，再加冷蒸馏水配成8%混悬液。 2.一般先给予受试药物数次或数天，末次给受试药30min后，灌胃给予8%番泻叶混悬液2g/kg体重。 3.灌服番泻叶后把小鼠置于单养笼内，笼底垫白色吸水纸或滤纸，记录灌服后16h内排出烂便或稀便的点数。,腹泻动物模型,模型评价与注意事项,造模方法简单易行，是目前国内应用较多的腹 泻模型之一。 2. 番泻叶的刺激作用比大黄强，大剂量易引起肠 道出血和炎症。,腹泻动物模型,2、肠功能试验 （1）正常小肠推进运动试验：应用小鼠或大鼠进行肠内容物推进运动试