核酸提取和注意事项-课件.ppt
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1、学 习 汇 报 核酸提取的原理及方法汇报人:富贵 青海大学2010级研究生1-前言 核酸是遗传信息的载体,是最重要的生物核酸是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此,核酸的提取是分子生物学实验技术因此,核酸的提取是分子生物学实验技术中 最 重 要、最 基 本 的 操 作。中 最 重 要、最 基 本 的 操 作。2-一一核酸简介核酸简介二二基因组基因组DNA提取提取三三质粒质粒DNA提取提取四四真核细胞总真核细胞总RNA提取提取五五琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳3-p 核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通
2、过3,5-磷酸磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖核二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖核酸酸(RNA)和脱氧核糖核酸和脱氧核糖核酸(DNA)两类。两类。p DNA主要储存遗传信息。主要储存遗传信息。p RNA主要传递遗传信息。主要传递遗传信息。4-如何分离如何分离DNADNA?如何分离如何分离RNARNA?5-核酸简介 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200 kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。6
3、-一核酸简介二基因组DNA提取三质粒DNA提取四真核细胞总RNA提取7-基因组DNA提取的几种常用方法:CTAB法 SDS法 其他方法8-基因组DNA提取CTAB法pCTAB法原理(植物DNA提取经典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中(0.7 mol/L NaCl)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。9-基因组DNA提取CTAB法pCTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl (pH 8
4、.0)EDTA(pH 8.0)NaCl CTAB-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 0.4 M2%(W/V)0.1%(V/V)使用前加入Tris-HCl(pH 8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子,抑制离子,抑制DNase活性;活性;NaCl 提供一个高盐环境,使提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液中;充分溶解,存在于液中;CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚
5、氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除。使酚容易去除。10-基因组DNA提取CTAB法 CTAB提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-HCl(pH 8.0)EDTA(pH 8.0)NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM0.4 M3%(W/V)5%(W/V)2%(V/V)使用前加入PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖时它也能和多糖结合,有效去除多糖。11-基因组DNA提
6、取CTAB法p CTAB法实验流程植物材料植物材料 抽提抽提核酸沉淀核酸沉淀液氮研磨液氮研磨上层溶液上层溶液细胞裂解细胞裂解DNADNA溶液溶液干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤12-基因组DNA提取SDS法pSDS法原理 SDS是一种阴离子去垢剂,在高温(5565)条件下能裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀;上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法适用于大部分实验材料基因组法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物组提取。如动物组织、细胞、全血、细菌、酵
7、母等。织、细胞、全血、细菌、酵母等。13-基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳:以琼脂糖凝胶作为支持以琼脂糖凝胶作为支持物,利用物,利用DNA分子在泳分子在泳动时的电荷效应和分子动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合筛效应,达到分离混合物的目的。物的目的。小鼠小鼠gDNA电泳图电泳图14-基因组DNA提取常见问题pDNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应p DNA降解p DNA量少15-基因组DNA提取常见问题分析pDNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应DNA中含有蛋白、多糖、多酚类物质中含有蛋白、多糖、多酚类物质 抽提纯化、高盐洗涤抽提纯化、高盐洗涤DNA在溶
8、解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应 重新沉淀重新沉淀DNA中残留有金属离子中残留有金属离子 重新重新70%乙醇漂洗乙醇漂洗16-基因组DNA提取常见问题分析 DNA降解 材料不新鲜或反复冻融材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈,提取过程操作过于剧烈,DNA被机被机械打断械打断 外源核酸酶污染外源核酸酶污染17-基因组DNA提取常见问题分析pDNA提取量少实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少 选取新鲜(幼嫩)材料选取新鲜(幼嫩)材料破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分 充分研磨、破壁酶、延长裂解
9、时间充分研磨、破壁酶、延长裂解时间沉淀不完全沉淀不完全 低温、延长沉淀时间低温、延长沉淀时间洗涤使得丢失洗涤使得丢失DNA18-一核酸简介二基因组DNA提取三质粒DNA提取四真核细胞总RNA提取五琼脂糖凝胶电泳19-质粒DNA提取p质粒DNA提取的方法:碱裂解法煮沸法20-质粒DNA提取碱裂解法原理21-离心柱型质粒DNA提取试剂盒工作原理 离心柱型质粒DNA提取试剂盒采用改进的 SDS-碱裂解法裂解细胞,离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后用低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。22-质粒
10、DNA提取及检测实验准备1.实验器材实验器材 台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、marker笔、笔、电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。2.实验耗材实验耗材 无菌无菌2 mL/1.5 mL EP管、各规格管、各规格Tip、一次性手套等。、一次性手套等。3.实验试剂实验试剂 质粒小提试剂盒(离心柱型,质粒小提试剂盒(离心柱型,YRBIO)、LB培养基、抗生素、培养基、抗生素、琼脂糖、琼脂糖、DNA Loading Buffer、GoldView核酸
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