免疫共沉淀原理及注意事项课件.ppt

1、一 实验原理 以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。问题：细胞怎样保持生理状态-不变性？抗X应用与区别v测定两种目标蛋白质是否在体内结合v确定一种特定蛋白质的新的作用搭档v 与只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）实验基本原理v 1.提取蛋白v 2.在细胞裂解液中加入抗X的抗体v 3.孵育后再加入 A或G(于 上)v 若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“YX抗X抗体 A或Gv

2、3.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（抗原、x抗体）有一个很重要的特性就是能与抗体的段结合 琼脂糖珠原理图解琼脂糖珠复合物v A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是）的区结合。v 目前多用 预先结合在 上。的作用及具体原理v“捕获”抗体，形成复合物，v 抗体-目的蛋白 非共价健结合v 共价结合v 加样缓冲液-煮沸变性-离心 v 管（抗体-目的蛋白-少量非特异性吸附蛋白）。二 特征优点（1 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态（2 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响（3 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物二 特征

3、局限性（1 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用（2 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用；（3 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。三 实验流程 提取细胞总蛋白 离心，上清电泳(抗原抗体)准备珠子，洗3遍 珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景)离心去珠子，取上清 测蛋白浓度(法)加一抗反应(4过夜)加珠子捕捉复合物(室温1h或4过夜)离心，收集沉淀，预冷 洗3遍 上样缓冲液悬浮沉淀，加热游离抗原、抗体、珠子 四 实验结果分析v 分析v 质谱分析检测目的蛋白结果分析 标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测

4、定才具有可靠性。=蛋白样品距加样端迁移距离（cm）溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）相对迁移率 以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。一抗一抗一抗一抗(兔抗兔抗)曝光后的蛋白条带曝光后的蛋白条带二抗二抗(辣根酶标记的羊抗兔辣根酶标记的羊抗兔)X光片曝光显影光片曝光显影 试剂试剂含有转印蛋白的膜含有转印蛋白的膜+转印膜上蛋白检测示意图转印膜上蛋白检测示意图 结果分析结果分析与质谱分析流程与质谱分析流程三 实验的关键v1.实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。v2.为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制

5、剂，低温下进行实验。v3.考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。v4.确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。？注意的问题：1.裂解液v 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（40或 100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。v 不能用高浓度的变性剂（0.2)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的。裂解液普利莱基因技术有限公司v 100 ：v 50 (7.4),150 ,1%40,

6、0.1%.（100元）v 说明：v 1.裂解液临用前可新鲜加入最终浓度为1的或其它蛋白酶抑制剂。v 2.裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用法但可用法或改良法测定蛋白浓度裂解液成分 国内博士：细胞裂解液：50（7.5），150 ,0.540,1 使用前加入至终浓度1、（混合物）。刘岩 300 20 ,8.0,300,0.2 ,10%（甘油）,0.2 ,0.2 202.1免疫沉淀中抗体的选择注意的问题：2.2抗体v使用对照抗体：（阴性和阳性）v 阴性：单克隆抗体：同一种属的 v兔多克隆抗体：正常兔v 阳性：细胞内某种蛋白的抗体（做膜蛋白A，用膜蛋白B）未检测到目得蛋白或蛋白很少 可能原因

7、 处理方法1.样品被蛋白酶降解：添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4以下冰上操作并防止冻融2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度3.抗抗体亲合力太低：选用适合于和/或的相应抗体4抗体未与珠子结合：选用适合于的相应珠子，正确保存防止变质或干燥5未暴露在融合蛋白构象的表面：改变融合表达部位6.裂解液严谨度太高：改用低严谨度裂解液目得蛋白高背景：v可能原因 处理方法v非特异蛋白结合 在无血清培养液中裂解细胞；v 在免疫沉淀前用()珠子预洗，v 免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂）v裂解液严谨度太低 改用高严谨度裂解液v实验仪器或液体被污染 使用洁净的仪器或液体v转移膜上的非特异吸附 戴手套，用镊子夹取，不要接触膜转移面试剂v v蛋白酶抑制剂（、）、。蛋白酶抑制剂（、）、。v洗涤缓冲液洗涤缓冲液v A A 琼脂糖琼脂糖v抗体抗体仪器、耗材 摇床、管、低温离心机、1.5管、制冰机、移液器、吸头、水浴锅、细胞刮子（乙醇洗干净风干）