（管理资料）生物技术制药-第六章-酶工程制药汇编课件.ppt

1、生物技术制药第六章-酶工程制药酶工程简介酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指自然酶制剂在工业上的规模应用。1953年，德国人提出了酶固定化技术。1969年，日本人用固定化技术拆分了DL-氨基酸。1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。酶的基础知识（一）酶是生物催化剂（一）酶是生物催化剂酶是生物细胞产生的、具有催化能力的酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。生物催化剂。催化高效性催化高效性专一性专一性：结构专一性；结构专一性；立体异构专一性立体异构专一性酶具有不稳定性酶具有不稳定性反应条件温和（二

2、）酶的化学本质（二）酶的化学本质蛋白质蛋白质酶酶单纯酶单纯酶结合酶结合酶（全酶）（全酶）=酶蛋白酶蛋白+辅因子辅因子辅因子辅因子辅酶辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基辅基 与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。金属激活剂金属激活剂 金属离子作为辅助因子。金属离子作为辅助因子。必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。性丧失。活性部位活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。直接有关的部位。必需基

3、团必需基团活性部位活性部位维持酶的空间结构维持酶的空间结构结合基团结合基团催化基团催化基团专一性专一性催化性质催化性质现代酶工程的主要内容a、酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；b、酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测；c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究；e、有机相中酶反应的研究；f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究；g、抗体酶、核酸酶的研究；h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。酶的来源从生物体中提取分离化学合成：固相合成多肽技术早期酶的生产多以动植物为主要原料早期酶的生产多以动植物为主要原

4、料植物提供的酶主要有：植物提供的酶主要有：蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。动物组织提供的酶主要有：动物组织提供的酶主要有：胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪生产的胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪生产的凝乳酶等。凝乳酶等。不适合大规模生产：动植物来源有限、生产不适合大规模生产：动植物来源有限、生产周期长，以及地理、气候和季节影响。周期长，以及地理、气候和季节影响。目前工业生产一般都以微生物为主要来源目前工业生产一般都以微生物为主要来源利用微生物生产酶制剂，具有如下优点：微生物种类繁多，酶的品种齐全。微生物生长繁殖快、生产周期短、产量高。培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉。微生物具有较强的

5、适应性和应变能力，可以通过各种遗传变异的手段，培育出新的高产菌株。所以，目前工业上应用的酶大多采用微生物发酵法来生产。酶的生产菌作为一个优良的产酶菌种应具备以下几点要求：作为一个优良的产酶菌种应具备以下几点要求：繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求，而繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求，而且最好是产生胞外酶的菌。且最好是产生胞外酶的菌。不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要。生有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要。产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体。产酶性能稳定，不易变异退化，不易

6、感染噬菌体。能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。生产菌的来源从菌种保藏机构和有关研究部门获得。大量的需要要从自然界中分离筛选。自然界是产酶菌种的主 要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分离初筛、纯化、复筛和生产性能检定等。菌种改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变、基因转移和基因克隆。目前常用的产酶微生物E.coliE.coli ：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶

7、、青霉素酰化酶、脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳半乳糖苷酶糖苷酶枯草杆菌枯草杆菌：主要用于生产：主要用于生产-淀粉酶、淀粉酶、-葡萄糖葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。氧化酶、碱性磷酸脂酶。啤酒酵母啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等等曲酶曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。基酰化酶和脂肪酶。其他产酶菌其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等菌等酶在医药领域的应用1.1.在疾病诊断方

8、面的应用在疾病诊断方面的应用由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温和等显著的催化特点，酶学诊断已经发展成为可和等显著的催化特点，酶学诊断已经发展成为可靠、简便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前靠、简便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前景。景。酶学诊断方法包括两个方面，一是根据体内原有酶学诊断方法包括两个方面，一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。(1)(1)根据体内酶活力的变化诊断疾病根据体内酶活力的变化诊断

9、疾病:一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于某一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内的某种或某些酶的活力发生相应的变化。故此，的某种或某些酶的活力发生相应的变化。故此，可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断出某些疾病。出某些疾病。(2)(2)用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病：用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病：人体在出现某些疾病时，由于代谢异常或者某些人体在出现某些疾病时，由于代谢异常或

10、者某些组织器官受到损伤，就会引起体内某些物质的量组织器官受到损伤，就会引起体内某些物质的量或者存在部位发生变化。通过测定体液中某些物或者存在部位发生变化。通过测定体液中某些物质的变化，可以快速、准确地对疾病进行诊断。质的变化，可以快速、准确地对疾病进行诊断。酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶来测定体液中某些物质的含量变化，从而诊断酶来测定体液中某些物质的含量变化，从而诊断某些疾病。某些疾病。2.2.在疾病治疗方面的应用在疾病治疗方面的应用-酶类制剂酶类制剂 酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病的酶称

11、为的酶称为药用酶药用酶。药用酶具有疗效显著，副作。药用酶具有疗效显著，副作用小的特点，在疾病的治疗方面的应用越来越用小的特点，在疾病的治疗方面的应用越来越广泛广泛消化类消化类：研究最早，是品种最：研究最早，是品种最多的一类酶多的一类酶.在这一类酶中主要有胃蛋白酶、在这一类酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶、凝乳酶、无花果酶、菠瓜酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶等。萝酶等。健美生消化酶帮助肠胃蠕动抗炎净创类抗炎净创类：目前在治疗上发展最快，用途最广：目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。的一种。多数是多数是蛋白质水解酶蛋白质水解酶，分解发炎部位纤维蛋白的，分

12、解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，-淀粉酶、淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等。胰脱氧核糖核酸酶等。血凝和解凝类血凝和解凝类：这类酶都是从血液中提取出来的。：这类酶都是从血液中提取出来的。凝血酶凝血酶的作用是促使血中纤维蛋白元变成不溶性的

13、作用是促使血中纤维蛋白元变成不溶性纤维蛋白纤维蛋白,从而促使血液凝固，防止微血管出血。从而促使血液凝固，防止微血管出血。纤维蛋白溶解酶纤维蛋白溶解酶的作用是溶解血块，为目前临床的作用是溶解血块，为目前临床上最新的一种酶制品上最新的一种酶制品,治疗血栓静脉炎、冠状动治疗血栓静脉炎、冠状动脉栓塞等。脉栓塞等。抑肽酶抑肽酶作为肽酶抑制剂，广泛应用于体外循环手作为肽酶抑制剂，广泛应用于体外循环手术，大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的术，大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的渗血，消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡渗血，消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡解毒类解毒类：主要作用是解除体内或因注射某

14、种药：主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的一种有害物质。物产生的一种有害物质。主要品种有主要品种有青霉素酶青霉素酶、过氧化氢酶过氧化氢酶和和组织胺酶组织胺酶等。等。青霉素酶能够分解青霉素分子中的青霉素酶能够分解青霉素分子中的一内酰胺一内酰胺环，使变成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引环，使变成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引起的过敏反应起的过敏反应。3.3.在药物生产方面的应用在药物生产方面的应用利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。这利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。这方面的应用日益增多。现已有不少药物包括一方面的应用日益增多。现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生产的些贵重药物都是由

15、酶法生产的 4.4.在分析检测方面的应用在分析检测方面的应用酶法检测或酶法分析酶法检测或酶法分析如：如：ELISA,ELISA,免疫组织化学，免疫组织化学，Western blotWestern blot中的中的HRPHRP第二节 酶的分离纯化1 1、细胞破碎、细胞破碎2 2、酶的提取、酶的提取3 3、酶的分离方法、酶的分离方法4 4、酶的组合分离纯化策略、酶的组合分离纯化策略5 5、酶的浓缩、干燥与结晶、酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的分离纯化技术路线一、酶的分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液

16、发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。二、酶的提取（一）（一）细胞破碎细胞破碎许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细胞破碎珠细胞破碎珠高压细胞破碎机高压细胞破碎机DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机1.1.采用缓冲体系：防采用缓冲体系：防P

17、HPH大幅度变化而失活大幅度变化而失活2.2.添加保护剂：防活性基团活性中心受影响添加保护剂：防活性基团活性中心受影响3.3.抑制水解酶的作用抑制水解酶的作用4.4.其他保护措施：温度，其他保护措施：温度，PHPH，搅拌，光照，氧，搅拌，光照，氧化等影响化等影响（二）酶的抽提（二）酶的抽提提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶剂或溶液提取对象提取对象盐溶液提取盐溶液提取0.020.020.5M0.5M的盐溶液的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶度较大的酶酸溶液提取酸溶液提取PH2PH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，用于提取在稀酸溶液

18、中溶解度大，且稳定性较好的酶且稳定性较好的酶碱溶液提取碱溶液提取PH8PH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶且稳定性较好的酶有机溶剂提有机溶剂提取取可与水混溶的有机溶剂可与水混溶的有机溶剂 用于提取那些与脂质结合牢固或用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶含有较多非极性基团的酶(三）沉淀分离沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理 盐析沉淀法盐析沉淀法不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同，在酶不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同，在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析液中添加一定浓度的中性盐，使酶或

19、杂质从溶液中析出沉淀出沉淀等电点沉淀法等电点沉淀法两性电解质在等电点时溶解度最低，不同的两性电解两性电解质在等电点时溶解度最低，不同的两性电解质有不同的等电点，通过调节溶液的质有不同的等电点，通过调节溶液的pHpH值，使酶或杂值，使酶或杂质沉淀析出质沉淀析出有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，添加一定酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出复合沉淀法复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来下来选择性变性沉选择性变性沉淀法淀

20、法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶而不影响所需的酶三、酶的纯化过滤与膜分离过滤与膜分离电泳电泳离子交换层析离子交换层析第三节 酶和细胞的固定化水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术酶应用过程中的一些不足酶应用过程中的一些不足酶的稳定性较差酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。酶的一次性使用酶的一次性使用：酶一般都是在溶液

21、中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。产物的分离纯化较困难产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。固定化技术固定化技术固定化技术就是为了克服酶在工业应用中的不足，使酶催化反应能像化学催化剂一样在多相反应过程中稳定操作，并易于回收和反复使用而发展起来的一项酶化学与酶工程技术。（一）固定化酶的制备（一）固定化酶的制备1 1、固定化酶固定化酶（immobilized enzymeimmobilized enzym

22、e）的）的定义定义:指限制或固定于特定空间位置的酶。指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为定化酶的过程称为酶的固定化酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。片上的酶或酶系。2、固定化酶的特点（1 1）可以多次使用，酶的稳定性提高；）可以多次使用，酶的稳定性提

23、高；（2 2）反应后，酶与底物和产物易于分开，）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。产物中无残留酶，易于纯化。（3 3）反应条件易于控制，可实现转化反）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；应的连续化和自动控制；（4 4）酶的利用率高，单位酶催化的底物）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；量增加，用酶量少；（5 5）比水溶性酶更适合于多酶反应。）比水溶性酶更适合于多酶反应。固定化酶缺点固定化时，酶活力有损失增加了生产成本、初始投资大只能用于可溶性底物，而且较适于小分子底物，不适宜大分子底物胞内酶必须经过酶的分离纯化于完整菌体相比不适宜多酶反应，特

24、别是需要辅助因子的反应固定化酶简介1916年Nelson和Griffin最先发现了酶的固定化现象。固定化酶的研究从20世纪50年代开始，1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核酸核糖酶等结合，制成固定化酶。20世纪60年代后期，固定化技术迅速发展。1969 年日本千佃一郎首次应用固定化氨基酰化酶从混合氨基酸中大规模生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。这时人们已经预感到了固定化酶以后可以在现代酶工程以及整个生物工程中占有的重要作用,它在应用上和理论上的巨大潜力吸引

25、了生物化学、微生物学、医学、化学工程和高分子等领域的科研机构及企业科技部门研究人员的注意力。固定化酶简介从1970年代初开始酶的固定化技术研究发展很快，促使酶工程作为一个独立学科从发酵工程中脱颖而出，才真正登上历史舞台。至1980年代初，每年约发表1,000篇以上的文献和近200篇专利，所报道的固定化方法达100种以上。1980年代中以后，酶和细胞固定化研究的发展速度开始减慢，从而有人认为，对酶的固定化技术应予以重新评价，理由是尽管已经做了大量研究工作，但工业中实际应用的案例尚少，经过近20年的研究，真正能获得规模应用的固定化酶，还仅局限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的几

26、个酶种。尽管如此，随着生物、信息和纳米技术的发展，以及对环境保护意识的增强，人们还在根据传统酶固定化技术存在的问题，不断探索改进、完善和发展新的酶固定化方法。作为生物、化学、材料、能源和环境等多学科的交叉点之一，酶的固定化研究仍不失为一个活跃的研究领域。固定化酶简介我国的固定化酶研究开始于1970 年,首先是微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作。对于固定化酶，曾经有过固相酶、水不溶酶、固定酶等多种名称。在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为immobilized enzyme。3、酶和细胞固定化方法酶的固定化(enzyme immob

27、ilization)是指采用有机或无机固体材料作为载体(carrier or support)，将酶包埋起来或束缚、限制于载体的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并可回收及重复使用的酶化学方法与技术。不使用固体材料作为载体，通过酶分子之间的相互交联形成聚集体，也可将酶固定化，称为无载体酶固定化1990年代初报道的交联酶晶体(crosslinked enzyme crystals，CLEC)就属于无载体固定化酶。按照存在状态来进行分类，酶大致可分为天然酶和化学修饰酶，从生物体内直接分离的酶称为天然酶，固定化酶应属于化学修饰酶在化学修饰酶中，除固定化酶外，还包括经过化学修饰的水溶性酶或应用分子生物

28、学技术构建的基因重组酶等。酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法 载体结合法载体结合法 交联法交联法 包埋法包埋法 网格型网格型 微囊型微囊型物理吸附法物理吸附法 离子结合法离子结合法 共价结合法共价结合法 热处理（细胞）热处理（细胞）酶和细胞固定化模式酶和细胞固定化模式（1 1）载体结合法）载体结合法将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。A.A.物理吸附法物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。活性碳化方法。活性碳,多孔玻璃多孔玻璃,树脂等树脂等优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可优点：

29、操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。故不常用降并污染产物。故不常用。B B、离子结合法、离子结合法：酶通过离子键：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。溶性载体上。DEAE-DEAE-纤维素等纤维素等优点：操作简单，处理条件温优点

30、：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。的氨基酸残基不易被破坏。缺点：载体和酶的结合力弱，缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或易受缓冲液种类或pHpH的影响，的影响，离子强度高时，酶易脱落。离子强度高时，酶易脱落。离子交换剂结合离子交换剂结合蛋白能力较强，蛋白能力较强，故常用故常用载体结合法在固定化酶的制备中是使用最早的方法。用这种方法制备固定化酶时，必须按酶的种类和性质，选择合适的载体和固载方法。因为所选用的载体种类和固载方法对酶的担载量和反应性能影响很大。载体的化学组成、表面形貌、颗粒度、孔径和孔结构、表面积、亲水性基团等是主

31、要考虑因素。一般而言，载体的亲水性基团越多，表面积越大，担载的酶量就越高，所制得的固定化酶活性也就越高。因为酶是生物大分子，通常首选纤维素、葡聚糖、琼脂糖、多糖类衍生物和聚丙烯酰胺凝胶等有机高分子载体，也可根据酶的性质和固定化方法选择合适的无机载体，如Al2O3、SiO2、TiO2和分子筛等，因为它们相对比较便宜，机械强度高，流体力学性质好，使用中不容易溶胀。C C、共价结合法、共价结合法：酶以共价键：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。反应基团进行共价结合的方法。优点：酶与载体结合牢固，

32、稳优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。定性好，不易脱落。(目前研目前研究最为活跃的一类酶固定化方究最为活跃的一类酶固定化方法法 )缺点：载体要活化，反应条件缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻烈，酶易失活和产生空间位阻效应效应,常常会引起酶蛋白高级常常会引起酶蛋白高级结构发生变化，并导致活性中结构发生变化，并导致活性中心受到破坏心受到破坏,难以得到比活高难以得到比活高的固定化酶，甚至底物的专一的固定化酶，甚至底物的专一性等性质也可能发生变化。性等性质也可能发生变化。共价结合法共价结合法 注意事项注意事项首先要注意载体活

33、化，使载体获得能与酶分子的某一特定基团发生特异反应的活泼基团。活化方法有酰基化、芳基化、烷基化和氨甲酰化反应等。酶蛋白上参与共价结合的氨基酸残基不应该是酶催化活性所必需的，避免固定化后酶活力丧失。反应条件尽可能温和。（2 2）交联法）交联法采用双功能团试剂或多功能团试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功能团试剂或多功能团试剂之间形成共价键，得到三维的交联网状结构常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2-2、2-2-二磺酸、二磺酸、1,5-1,5-二氟二氟-2,4-2,4-二硝基苯。二硝基苯。酶分子之间酶分子之间共价交联共价交联和与水不溶性载体和与水不溶性载体共

34、价结合共价结合 酶分子；（酶分子；（a a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（相互交联成水不溶性的固定化酶；（b b）酶分子被偶联到水不）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶溶性载体上形成水不溶性的固定化酶交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。交联法、吸附交联法和载体交联法。见见p222p222交联法反应条件剧烈，固定化酶的酶活交联法反应条件剧烈，固定化酶的酶活回收率低（故回收率低（故尽可能降低交联剂浓度尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间和缩短反应

35、时间），会引起酶活性中），会引起酶活性中心结构的改变，导致酶活性降低（心结构的改变，导致酶活性降低（常常加入辅助蛋白如牛血清蛋白提高固定加入辅助蛋白如牛血清蛋白提高固定化酶的稳定性化酶的稳定性），因此常与吸附法或），因此常与吸附法或包埋法联合使用。包埋法联合使用。（3）包埋法包理法是将酶包裹于凝胶形成的网络结构中，或半透膜聚合物的超滤膜内使其固定化。适用于多种酶、粗酶制剂、细胞器和细胞的固定化。包埋法可分为网络型和微囊型两种。前者是将酶包埋于高分子凝胶细微网络内；而后者是将酶包埋在高分子半透膜中制备成微囊型。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的空间构象，酶活回收率较高

36、，因此可以应用于许多酶的固定化。但是包埋法制备的固定化酶，只适合用于小分子底物和产物的酶催化反应，因为只有小分子反应底物或产物，才可以通过高分子凝胶的网格进行扩散。由这种固定化方法产生的扩散阻力，还会使固定化酶的动力学行为发生改变，从而降低酶活力。A A、网格型、网格型：将酶或细胞将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微包埋在高分子凝胶细微网格中。网格中。常用合成高分子化合物常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。叉菜胶。多用于固定化多用于固定化细胞细胞B

37、B、微囊型、微囊型：将酶或细将酶或细胞包埋在高分子半透膜胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米中。通常为直径几微米到几百微米的球状体。到几百微米的球状体。颗粒比网格型要小得多，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要的扩散，但反应条件要求高，制备成本也高。求高，制备成本也高。（4 4）选择性热变性法选择性热变性法专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定理使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。于细胞内的方法。4、酶和细胞的固定化载体载体条件：固定化过程中不引

38、起酶变性对酸碱有一定的耐受性有一定的机械强度有一定的亲水性和良好的稳定性有一定的疏松网状结构，颗粒均匀共价结合时具有可活化基团有耐受酶和微生物细胞的能力价廉易得、经济环保固定化载体主要有三类：吸附载体、包埋载体和共价结合载体（二）新型的酶固定化方法温和的条件温和的条件下进行，减少酶活力损失，下进行，减少酶活力损失，提高固定化效率提高固定化效率光偶联法光偶联法：光敏性单体聚合物包埋固定：光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶酶等离子体法等离子体法：高度激发的原子、分子，：高度激发的原子、分子，自由基的聚集体，载体表面用等离子体自由基的聚集体

39、，载体表面用等离子体修饰，引入活性基团修饰，引入活性基团无载体固定化酶无载体固定化酶直接用交联剂交联直接用交联剂交联 用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集酶、用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集酶、和喷雾干燥酶等四种无载体酶体系，优点如下：和喷雾干燥酶等四种无载体酶体系，优点如下：1.催化活性高，成本低催化活性高，成本低 2.具备较高的催化剂比表面具备较高的催化剂比表面 3.可加入多种酶可加入多种酶 4.底物扩散受限制少底物扩散受限制少 5.极端条件下稳定性高极端条件下稳定性高（三）固定化细胞的方法通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合，制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。固定化细胞是指固定在

40、载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，故也称为固定化活细胞、固定化增值细胞、第二代固定化酶。微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成固定化细胞。固定化细胞可以提高生产效率,延长生产周期,并易于细胞的分离和回收。目前,固定化细胞技术已应用于食品工业、发酵工业和三废处理工业,经济效益显著。固定化细胞简介固定化酶和固定化菌体的应用进一步推动了固定化技术的发展。20世纪70年代后期出现固定化细胞技术。由于固定化细胞技术不需要把酶从细胞中提取出来,酶活力损失少,酶活回收率较高,因此该技术的应用已经超过固定化酶的应用。细胞被固定化后细胞密度高、反应速度快

41、、耐毒害能力强、产物分离容易、能实现连续操作,可以大大提高生产能力等优势,因此在近几十年来固定化细胞技术得到了迅速的发展和广泛的应用。通常只能用于胞外酶等胞外产物的生产。1959 年Hattori首次将大肠杆菌E.coli 吸附在树脂上实现细胞固定化,随后固定活细胞或称为固定化增殖细胞的研究工作相继展开。1973年,含有L-天冬氨酸酶的微生物被固定化,并用于L-天冬氨酸的生产。1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精。1978年，日本固定化枯草杆菌细胞生产-淀粉酶；1984年，中国开始进行固定化细胞生产-淀粉酶、糖化酶和果胶酶等的研究。固定化细胞简介20世纪70年代中期以来，动植物细

42、胞培养技术迅速发展。动物细胞主要用于生产疫苗、抗体、多肽药物、酶等功能蛋白质，其中大多数动物细胞具有贴壁生长的特性，采用固定化动物细胞培养技术，更加具有重要意义。植物细胞也可以采用固定化植物细胞培养。动植物细胞固定化的研究和应用进一步扩展了固定化技术的研究、开发。近年来还开展了固定化动植物细胞生产次级代谢产物的研究工作。固定化细胞特点固定化微生物细胞的特点：固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好。固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制。发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长的一段时间。固

43、定化微生物细胞密度提高，可以提高产率。提高工程菌的质粒稳定性。固定化植物细胞的特点：植物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可减轻剪切力和其他外界因素对植物细胞的影响，提高植物细胞的存活率和稳定性。细胞经固定化后，被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易聚集成团。固定化植物细胞发酵可以简便地在不同地培养阶段更换不同的培养液，即首先在生长培养基中生长增殖，在达到一定的细胞密度后，改换成发酵培养基，以利于生产各种所需的次级代谢物。固定化植物细胞可反复使用或连续使用较长的一段时间，大大缩短生产周期，提高产率。固定化植物细胞易于与培养液分离，利于产品的分离纯化，提高产品质量。固定化动物细胞的特点

44、：提高细胞存活率：动物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可以减轻或免受剪切力的影响，同时动物细胞可附着在载体表面生长，从而可显著提高动物细胞的存活率。提高产率：动物细胞固定化后，可先在生长培养基中生长繁殖，使细胞在载体上形成最佳分布并达到一定的细胞密度。然后可简便地改换成发酵培养基，控制发酵条件，使细胞从生长期转变到生产期，以利于提高产率。固定化动物细胞可反复使用或连续使用较长的时间。例如，中国仓鼠卵巢细胞（CHO）生产人干扰素可以稳定地生产30天。固定化细胞易于与产物分开，利于产物分离纯化，提高产品质量。固定化细胞的优点无需进行酶的分离纯化，节约酶的分离过程及费用;属于多酶系统，可催化一

45、系列反应，无需辅酶再生;细胞生长停滞时间短，抗污染能力强;固定化细胞可以重复或长期使用，简化游离细胞培养过程，还减少了营养基质的浪费;保持酶的原始状态,提高酶的稳定性;使用固定化细胞反应塔连续发酵,可以避免反馈抑制和产物的消耗。固定化细胞的缺点部分载体材料有时会对细胞产生生理毒性,将导致细胞死亡,菌体自溶,影响产物的纯度或影响目标代谢产物的生物合成;细胞膜或细胞壁会造成底物渗透和扩散的障碍;有些载体材料使细胞或小细胞群体相互分隔,容易形成不利于细胞之间彼此协调的环境,影响代谢产物的生物合成;大规模制备固定化细胞过程复杂,易引起杂菌污染;细胞内有多种酶存在,会形成副产物;载体材料使成本提高,以至

46、于该技术在传统的发酵工业中难以推广。固定化细胞的制备技术固定化细胞的制备技术细胞固定化主要适用于胞内酶，要求底物和产物透过细胞膜，细胞内不存在产物分解系统及其他副反应。载体结合法、包埋法、交联法、无载体法（1 1）载体结合法制备技术）载体结合法制备技术 将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载体主要为阴离子交换树脂、阴结合。载体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。离子交换纤维素、聚氯乙烯。优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶活性。影响细胞的生长及酶活性。缺点：吸附容量小、结合强度低。缺点：吸

47、附容量小、结合强度低。（2 2）包埋法制备技术）包埋法制备技术与包埋酶法相同，将细胞定位于凝胶网格内。与包埋酶法相同，将细胞定位于凝胶网格内。是固定化细胞中应用最多的方法。是固定化细胞中应用最多的方法。常用载体有卡拉胶、聚乙烯醇、琼脂等。常用载体有卡拉胶、聚乙烯醇、琼脂等。优点：细胞容量大，操作简便，酶的活力回优点：细胞容量大，操作简便，酶的活力回收率高收率高缺点：扩散阻力大，容易改变酶的动力学行缺点：扩散阻力大，容易改变酶的动力学行为，不适于催化大分子底物与产物的转化为，不适于催化大分子底物与产物的转化反应。反应。（3 3）交联法制备技术：）交联法制备技术：由于所用交联剂由于所用交联剂戊二醛

48、等对细胞有毒性，一般很少用。戊二醛等对细胞有毒性，一般很少用。（4 4）无载体法制备技术：）无载体法制备技术：靠细胞自身的靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。通过助絮凝作用制备固定化细胞的技术。通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。可以获得高密度细胞，固定化条件定化。可以获得高密度细胞，固定化条件温和，但是机械强度差。温和，但是机械强度差。此外还有粘合法，截留法等此外还有粘合法，截留法等（四）固定化方法与载体的选择依据酶可以通过各种不同的方法进行固定化，但不管是通过物理的弱相互作用，还是通过较强的化学键结合，都必须采用不溶于水的材料作为固定化

49、载体任何一种固定化方法或固定化载体，都不可能适用于所有的酶，要想获得较好的固定化效果，必须根据具体的酶和催化反应类型，选择合适的固定化方法和载体和多相化学催化剂的制备一样，要想通过选择固定化方法和载体，制备出性能最佳的固定化酶，没有现成的规律可循，往往依赖于实际工作经验的积累，最后以是否能最大限度地保留酶活性和提高酶的稳定性为评价标准。固定化方法的选择依据（1 1）固定化酶应用的安全性固定化酶应用的安全性：要按照药：要按照药物和食品领域的检验标准作必要的检查。物和食品领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。择无毒性试剂。（2

50、 2）固定化酶在操作中的稳定性固定化酶在操作中的稳定性：在选：在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。济上有极强的竞争力。（3 3）固定化的成本固定化的成本：包括酶、载体、试：包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、电、气、设剂的费用，也包括水、电、气、设 备和备和劳务投资等劳务投资等。注意综合考虑。载体的选择为了工业化应用，最好选择工业化生产为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体，如聚中已大量应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交换乙