VIG病毒诱导基因沉默技术(课件).ppt

1、1VIG病毒诱导基因沉默技术2What are RNAWhat are RNAi?RNA干扰广泛存在于生物界，在不同物种中RNA干扰被赋予不同的名称:在植物体中被称为基因共抑制（co-suppression）在真菌中被称为基因阻抑（qulling）在动物体内被称为RNA（RNAi）现今用于植物RNAi技术按导入方式的不同有粒子轰击、病毒诱导基因沉默(VIGS)、农杆菌介导等方式。3Virus Induced Gene Silencing(VIGS)病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是指通过对已知植物病毒的改造，将目标基因片段整合入病毒载体中

2、，然后侵染植物,诱发RNAi途径,随着病毒的复制和转录而特异性地诱导序列同源基因mRNA降解或被甲基化等修饰，从而引起植物表型或生理指标变化，实现对该功能基因的鉴定。4VIGS原理原理 dsRNA:双链RNA;Dicer酶:核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)家族的成员;siRNA:小干扰RNA;RISC:RNA诱导沉默复合体5VIGS应用的载体应用的载体利用植物病毒作为载体的优点:病毒能吸附到完整的植物细胞并将它们的核酸导入到细胞中 感染的植物细胞产生大量的病毒，因此重组病毒载体可以高效表达转入的外源基因。病毒感染可以蔓延整个植株 病毒感染快6VIGS应用的载体应用的载体RNA

3、病毒(最早最多)1995,首次基于烟草花叶病毒TMV载体构建(携带八氢番茄红素脱氢酶PDS侵染烟草，上位叶片褪绿白化)1998,马铃薯X病毒PVX(沉默PDS诱发白化效应)2001,烟草脆裂病毒TRV(因其具有病毒症状较轻、沉默效率高、持续时间长、能够侵染分生组织应用，目前应用最广泛VIGS载体)lPDS即八氢番茄红素脱氢酶，是类胡卜素合成所必需的酶，具保护叶绿素免受光漂白的作用，而PDS基因发生沉默后被侵染植物就会表现出光漂白症状。lPDS表型变异易于辨别，因此PDS基因成为VIGS体系评价的参照基因。7VIGS应用的载体应用的载体DNA病毒(载体构建简便、无需体外转录、操作难度低)1998

4、,基于双生病毒番茄金色花叶病毒TGMV的VIGS体系成功建立(第一例DNA病毒载体)2004,非洲木薯花叶病毒ACMV2008,棉花皱叶病毒CLCrV2010,水稻东格鲁杆状病毒RTBV(实现农杆菌介导接种高效沉默水稻內源基因PDS，第1例能够通过农杆菌介导接种水稻的VIGS载体)8VIGS应用寄主应用寄主 寄主范围有限，针对不同的寄主植物往往需要开发不同的病毒载体。2002，大麦抑制PDS（大麦条纹花叶病毒BSMV，进一步在小麦上应用）2006，水稻、大麦和玉米（雀麦花叶病毒BMV 2006，大豆（多组分病毒菜豆荚斑驳病毒BPMV）2010，大豆（改造后无需体外转录，增加沉默效率）9VIGS

5、的应用的应用 抗旱研究中相关基因的功能分析 2011，沉默小麦上S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(SAMDC)、-谷氨酰半胱氨酸合成更美基因(-ECS)三个基因。沉默植株经干旱胁迫后较正常植株在形态上有明显的变化，其叶片的卷曲萎蔫程度较为突出，说明这三个基因在小麦抗干旱胁迫中具有重要功能。10VIGS的应用的应用 品质改良相关基因的功能分析 2012，利用VIGS技术发现高分子量谷蛋白亚基HMV-GS 1Bx14和小麦籽粒中麦谷蛋白聚合体合成有关。这也是首次报道VIGS技术应用于小麦穗子和籽粒相关的基因功能，同时这个体系的建立将会对研究与籽粒品质和在小麦渐成的

6、籽粒中有关基因的功能起到很大帮助作用。11VIGS优点优点 在未获取全长序列甚至事先不知道序列的情况下即可进行VIGS分析。操作简便，能快速获取表型。无需构建转基因植株。这对于那些转基因植株获取非常困难的植物种类来说至关重要 可用于突变致死的基因功能研究。可用于功能冗余基因的功能研究。可用于快速的不同植物种类间比较基因组学的研究。12VIGS缺陷缺陷 VIGS引起目标基因的沉默特征不具有遗传性，以致VIGS技术并不能彻底揭示基因的功能，这是此种技术自身最大的局限性。如何获得目标基因的系统性沉默仍然是VIGS技术目前需要解决的问题。沉默持续的时间问题。病毒载体如何有效地接种入植物体内，并产生较强的沉默效果，是VIGS技术实验操作中的关键性步骤。1314感谢您的聆听您的关注使我们更努力