硅胶柱层析技术课件.ppt
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- 硅胶 层析 技术 课件
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1、硅胶柱层析技术硅胶柱层析技术 常说的过柱子应该叫柱层析常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱。我们常用的是分离,也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。其实硅胶柱层析技术也可以其实硅胶柱层析技术也可以称作硅胶吸附柱色谱技术称作硅胶吸附柱色谱技术 色谱法,又称层析法。是一种以分配平衡为机理色谱法,又称层析法。是一种以分配平衡为机理的分配方法。色谱体系包含两个相,一个是固定的分配方法。色谱体系包含两个相,一个是固定相,一个是流动相。当两相相对运动时,反复多相,一个是流动相。当两相相对运动时,反复多次的利用混合物中所含各组分分配平衡性质的差次的利用混
2、合物中所含各组分分配平衡性质的差异,最后达到彼此分离的目的。异,最后达到彼此分离的目的。色谱法按固定相的状态可分为柱色谱、平板色谱色谱法按固定相的状态可分为柱色谱、平板色谱和棒色谱三种,而实验室中最常用的是柱层析和和棒色谱三种,而实验室中最常用的是柱层析和薄层层析,以及它们之间的配合应用。薄层层析,以及它们之间的配合应用。柱层析1、吸附色谱的原理、吸附色谱的原理 在一定条件下,硅胶与被分离物质之间产生作用,这种作用主要是在一定条件下,硅胶与被分离物质之间产生作用,这种作用主要是物理和化学作用两种。物理作用来自于硅胶表表面与溶质分子之间的物理和化学作用两种。物理作用来自于硅胶表表面与溶质分子之间
3、的范德华力;化学作用主要是硅胶表面的硅羟基与待分离物质之间的氢范德华力;化学作用主要是硅胶表面的硅羟基与待分离物质之间的氢键作用。键作用。2、操作步骤、操作步骤2.1 硅胶准备硅胶准备 硅胶一般选用硅胶一般选用250-400目目(即即40-63m直径的硅胶颗粒直径的硅胶颗粒),根据,根据Rf选用硅胶的用量。选用硅胶的用量。2.2 实验仪器准备实验仪器准备 一支玻璃色谱柱一支玻璃色谱柱,一个铁架台一个铁架台,烧杯烧杯,锥形瓶锥形瓶,径口直径较大的玻璃漏斗径口直径较大的玻璃漏斗,一支玻璃棒一支玻璃棒,等。等。2.3 装柱装柱2.3.1 吸附剂的加入吸附剂的加入干法:将吸附剂一次加入色谱管,振动管壁
4、使其均匀下沉,然后沿管干法:将吸附剂一次加入色谱管,振动管壁使其均匀下沉,然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相,或将色谱管下端出口加活塞,壁缓缓加入开始层析时使用的流动相,或将色谱管下端出口加活塞,加入适量的流动相,旋开活塞使流动相缓缓滴出,然后自管顶缓缓加加入适量的流动相,旋开活塞使流动相缓缓滴出,然后自管顶缓缓加入吸附剂,使其均匀地润湿下沉,在管内形成松紧适度的吸附层。操入吸附剂,使其均匀地润湿下沉,在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。湿法:将吸附剂与流动相混合,搅拌以除去空气泡,徐徐倾入色谱管湿法:
5、将吸附剂与流动相混合,搅拌以除去空气泡,徐徐倾入色谱管中,然后再加入流动相,将附着于管壁的吸附剂洗下,使色谱柱表面中,然后再加入流动相,将附着于管壁的吸附剂洗下,使色谱柱表面平整。平整。俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下,液面将与柱表俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下,液面将与柱表面相平时,即加试样溶液。面相平时,即加试样溶液。2.3.2试样的加入试样的加入 将试样溶于层析时使用的流动相中,再沿色谱管壁缓缓加入。注意勿将试样溶于层析时使用的流动相中,再沿色谱管壁缓缓加入。注意勿使吸附剂翻起。使吸附剂翻起。或将试样溶于适当的溶剂中,与少量吸附剂混匀,再使溶剂挥发去尽或将试样溶于适当的溶剂
6、中,与少量吸附剂混匀,再使溶剂挥发去尽后使呈松散状;将混有试样的吸附剂加在已制备好的色谱柱上面。如后使呈松散状;将混有试样的吸附剂加在已制备好的色谱柱上面。如试样在常用溶剂中不溶解,可将试样与适量的吸附剂在乳钵中研磨混试样在常用溶剂中不溶解,可将试样与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。匀后加入。2.4洗脱洗脱 除另有规定外,通常按流动相洗脱能力大小,递增变换流动相的品除另有规定外,通常按流动相洗脱能力大小,递增变换流动相的品种和比例,分别分部收集流出液,至流出液中所含成分显著减少或不种和比例,分别分部收集流出液,至流出液中所含成分显著减少或不再含有时,再改变流动相的品种和比例。操作过程中应保
7、持有充分的再含有时,再改变流动相的品种和比例。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。流动相留在吸附层的上面。2.5 检测检测2.5.1 初步检测初步检测 当冲洗溶剂流出一定量后,可对流出液进行初步检测,并且将锥形当冲洗溶剂流出一定量后,可对流出液进行初步检测,并且将锥形瓶更换成小试管进行收集。一般只进行初步的快捷检测,因此通常是瓶更换成小试管进行收集。一般只进行初步的快捷检测,因此通常是取一小薄层板,用铅笔和直尺将硅胶板分划成多个小方块,并按一定取一小薄层板,用铅笔和直尺将硅胶板分划成多个小方块,并按一定的次序编号。取一根内径为的次序编号。取一根内径为0.3mm左右的玻璃毛细管蘸取少
8、量流出左右的玻璃毛细管蘸取少量流出液,点于薄层板的一个小格内,待半点干后,然后用物理的或化学的液,点于薄层板的一个小格内,待半点干后,然后用物理的或化学的方法检测。方法检测。2.5.2 正式检测正式检测点样点样:取分部收集的冲洗溶液进行分别直接点样取分部收集的冲洗溶液进行分别直接点样,如果冲洗溶液太稀如果冲洗溶液太稀,浓浓度太小度太小,可先浓缩可先浓缩.点样的容器一般用玻璃毛细管点样的容器一般用玻璃毛细管,点样斑点的直径一般点样斑点的直径一般为为3-5mm.展开展开:在普通的展开槽中进行在普通的展开槽中进行,展开方式常选用上行展开展开方式常选用上行展开.展开剂展开剂:使用冲洗溶液使用冲洗溶液.
9、显色显色:一般常用物理检测法和化学检测法一般常用物理检测法和化学检测法.物理检测法中首先有紫外光物理检测法中首先有紫外光法法,紫外光常用两种波长紫外光常用两种波长(254nm与与365nm).其次是碘蒸气显色法其次是碘蒸气显色法.化学检出法通常惊醒显色剂直接喷雾化学检出法通常惊醒显色剂直接喷雾.显色剂有通用显色剂和专用显显色剂有通用显色剂和专用显色剂色剂.通用显色剂最常见的是硫酸通用显色剂最常见的是硫酸-乙醇或甲醇乙醇或甲醇(1:1)溶液溶液,喷雾后喷雾后,有的有的化合物立即反应化合物立即反应,但多数化合物需加热后经历数分钟才显色但多数化合物需加热后经历数分钟才显色,不同化合不同化合物的反应不
10、同物的反应不同,所以颜色也往往不同所以颜色也往往不同.专用显色剂是指对某个或某一类专用显色剂是指对某个或某一类化合物显色的试剂化合物显色的试剂,利用化合物本身的特有性质利用化合物本身的特有性质,或利用其所含的某些或利用其所含的某些官能团的特殊反应官能团的特殊反应.展开后根据斑点的展开后根据斑点的,可以粗略的估计待分离物的含可以粗略的估计待分离物的含量的大小量的大小.2.6 合并合并 根据上面薄层检测的结果根据上面薄层检测的结果,我们可以将具有相同我们可以将具有相同Rf值的部分进行合并值的部分进行合并,然后利用旋转蒸发器对合并部分进行旋转蒸发然后利用旋转蒸发器对合并部分进行旋转蒸发,最后得到我们
11、需要的最后得到我们需要的目标产物目标产物.2.7色谱柱的洗涤色谱柱的洗涤 在绝大多数情况下在绝大多数情况下,硅胶分离柱中的硅胶是一次性使用硅胶分离柱中的硅胶是一次性使用,但在使用后但在使用后的色谱柱中由于还含有冲洗溶剂的色谱柱中由于还含有冲洗溶剂,所以要将里面的硅胶到出是比较困所以要将里面的硅胶到出是比较困难的难的.取出硅胶的一种方法是将该柱放置一段时间取出硅胶的一种方法是将该柱放置一段时间,让溶剂自然挥发完让溶剂自然挥发完后后,倒出硅胶倒出硅胶.但这种方法既费时又污染环境但这种方法既费时又污染环境.第二种方法可以用一根比第二种方法可以用一根比色谱柱稍长的木杆或塑料杆将含有溶剂的硅胶一段一段地
12、掏出色谱柱稍长的木杆或塑料杆将含有溶剂的硅胶一段一段地掏出,但这但这种办法也比较麻烦种办法也比较麻烦.第三种方法时利用一个一般地真空泵第三种方法时利用一个一般地真空泵,将柱中剩余将柱中剩余的溶剂进行减压抽出的溶剂进行减压抽出,在色谱柱和真空泵之间加一个冷阱在色谱柱和真空泵之间加一个冷阱,这样抽出地这样抽出地溶剂既进行了有效地收集而不污染环境溶剂既进行了有效地收集而不污染环境,而色谱柱中地硅胶又能较快而色谱柱中地硅胶又能较快得到干燥得到干燥,使硅胶能够方便地倒出使硅胶能够方便地倒出.3、色谱柱的选择、色谱柱的选择 柱子可以分为:加压,常压,减压。柱子可以分为:加压,常压,减压。压力可以增加淋洗剂
13、的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易
14、分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。气(很大的噪音,而且时间长)。加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵(给鱼剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可缸供气的就行)。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。过大,不然溶剂走的太快就会减低分离
15、效果。常压柱色谱,又称柱层析,是色谱法中最常见的一种。它的突出优点常压柱色谱,又称柱层析,是色谱法中最常见的一种。它的突出优点是,分离效率比经典的化学分离方法高的多,与其他色谱法相比,不是,分离效率比经典的化学分离方法高的多,与其他色谱法相比,不需要昂贵的仪器设备,更换流动相和吸附剂方便,消耗材料少,成本需要昂贵的仪器设备,更换流动相和吸附剂方便,消耗材料少,成本低,适合分离取样量从克到微克级范围很宽的各种样品,因此在化学低,适合分离取样量从克到微克级范围很宽的各种样品,因此在化学实验室中至今仍被广泛应用。实验室中至今仍被广泛应用。4 溶剂的选择溶剂的选择 溶剂的选择也许是整个柱色谱分离操作中
16、最困难之处溶剂的选择也许是整个柱色谱分离操作中最困难之处,也是实验成功也是实验成功的最关键之处的最关键之处.溶剂通常先利用简便的硅胶薄层色谱进行筛选溶剂通常先利用简便的硅胶薄层色谱进行筛选.4.1 薄层色谱点样薄层色谱点样 把样品溶解在一种低沸点的有机溶剂中把样品溶解在一种低沸点的有机溶剂中(如氯仿如氯仿,丙酮丙酮.甲醇甲醇.乙醇等乙醇等)然后用毛细管或微量点样管将试液点到薄层板上然后用毛细管或微量点样管将试液点到薄层板上.点样量要适当点样量要适当,一般一般点样量少些点样量少些,则分离叫清晰则分离叫清晰.但要注意到检测灵敏度但要注意到检测灵敏度.4.2 展开展开4.2.1展开剂选择展开剂选择
17、选择展开剂时选择展开剂时,可采用微量圆环法和小型色谱法进行选择可采用微量圆环法和小型色谱法进行选择.微量圆环法微量圆环法:将欲分离的物质将欲分离的物质,按常规方法点在薄板按常规方法点在薄板,两点相距两点相距2-3cm,再用毛细管吸取所实验的溶剂系统再用毛细管吸取所实验的溶剂系统,垂直放于样点中心垂直放于样点中心,让溶剂自毛细让溶剂自毛细管中依中立流出进行展开管中依中立流出进行展开,干燥后显色干燥后显色.观察斑点的分离情况观察斑点的分离情况.背试物质背试物质为未知化和物时为未知化和物时,常先用低极性溶剂展开常先用低极性溶剂展开,如式样留在圆点不动如式样留在圆点不动,则需增则需增加溶剂的极性或增大
18、洗脱液的量加溶剂的极性或增大洗脱液的量,如移动过快如移动过快,则必须用较低极性的溶则必须用较低极性的溶剂来调整剂来调整.小型色谱法小型色谱法.用普通的载薄片制成薄板用普通的载薄片制成薄板,把欲分离的物质点载薄板上把欲分离的物质点载薄板上,放放于小型玻璃缸或广口瓶中展开于小型玻璃缸或广口瓶中展开,干燥后显色干燥后显色,观察斑点分离情况观察斑点分离情况.4.2.2 展开展开薄层色谱的展开方法有上行法薄层色谱的展开方法有上行法,下行法下行法,双向展开法双向展开法,径向展开法等。径向展开法等。上行法上行法:使展开剂由下向上爬使展开剂由下向上爬.下行法下行法:使展开剂由上向下使展开剂由上向下.该法可使用
19、极性较弱的展开剂该法可使用极性较弱的展开剂.双向展开法双向展开法:取方形薄板像纸色谱一样进行双向展开取方形薄板像纸色谱一样进行双向展开.径向展开法径向展开法:可将吸附剂涂成圆形或扇形可将吸附剂涂成圆形或扇形,在圆心部分加如展在圆心部分加如展开剂开剂,使薄层径向展开使薄层径向展开.多次展开多次展开:用展开剂对薄层展开一次用展开剂对薄层展开一次.称为单次展开称为单次展开.一次展开一次展开后后,取出薄板取出薄板,挥发出去展开剂后再行展开挥发出去展开剂后再行展开.梯度展开梯度展开:该法所用的展开剂在连续不断的改变组成该法所用的展开剂在连续不断的改变组成.一般可一般可把一个装有强极性展开剂的滴定管深入密
20、闭的含弱极性的展开剂的层把一个装有强极性展开剂的滴定管深入密闭的含弱极性的展开剂的层析槽中析槽中,槽中用电磁搅拌器把滴下的强极性展开剂混匀槽中用电磁搅拌器把滴下的强极性展开剂混匀,此时此时,展开剂的展开剂的极性逐渐由弱变强极性逐渐由弱变强,使极性差别较大的多种组分混合物得以很好的分使极性差别较大的多种组分混合物得以很好的分离离.4.3 显色显色 展开后展开后,如物质有色如物质有色,可明显的在薄层上观察到它们的位置可明显的在薄层上观察到它们的位置.如无色如无色,则则要通过一定的方法显色要通过一定的方法显色,定位定位,一边确定斑点的位置及大小一边确定斑点的位置及大小.4.4 常用溶剂的极性常用溶剂
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