军团菌及其检测方法课件.ppt
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- 军团 及其 检测 方法 课件
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1、军团军团菌及其检测技术菌及其检测技术武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科赵滢赵滢 博士博士EMAIL:2014年年11月月武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科军团菌的发现l 1976年7月在美国费城,参加退伍军人大会的人员中爆发了一种症状相同,原因不明的细菌性肺炎,有221人感染疾病,其中死亡34人。l 初步的流行病学分析显示,致病的微生物可能通过空气传播,采集标本,分离病原体l 革兰氏阴性杆菌嗜肺军团菌(L.pneumophila)l 军团菌病(已知的首次爆发)武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科
2、Part I:军团菌及军团菌病武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科军团菌军团菌革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌,浅红色的短杆菌,直径浅红色的短杆菌,直径0.30.30.5m0.5m,长约,长约1.21.25m5m或更长,或更长,菌体一端有鞭毛菌体一端有鞭毛.在含在含L L-半胱氨酸和焦磷酸铁的半胱氨酸和焦磷酸铁的BCYEBCYE琼琼脂培养基上生长,通常需要在脂培养基上生长,通常需要在3737 5%5%CO2培养箱培养箱培养培养2-102-10天。天。生长形成的菌落一般呈白色,也可能生长形成的菌落一般呈白色,也可能会从紫色变为蓝色,或是灰绿色。会从紫色变为蓝色,或是灰绿色
3、。初步在初步在BCYEBCYE琼脂培养基上生长的菌落为琼脂培养基上生长的菌落为刻花玻璃样,具有多型性刻花玻璃样,具有多型性.武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科军团菌科、属、种、血清型军团菌科、属、种、血清型u军团菌科军团菌科 (LegionellaceaeLegionellaceae )LegionellaLegionella/FluoribacterFluoribacter bozemaniibozemanii/TatlockiaTatlockia micdadeimicdadei u军团菌属:军团菌属:16s 16s rRNArRNA分析表明,在蛋白细菌系
4、分析表明,在蛋白细菌系亚群中,亚群中,军团菌科只有一个军团菌亚群。与引起军团菌科只有一个军团菌亚群。与引起Q Q热病的热病的coxiellacoxiella burnetiburneti(贝氏克斯体)亲缘关系最近,二者具有同样的细贝氏克斯体)亲缘关系最近,二者具有同样的细胞内生活方式,可以利用共同的基因感染宿主细胞。胞内生活方式,可以利用共同的基因感染宿主细胞。u军团菌种军团菌种:现已发现:现已发现5050个种(个种(speciesspecies),),7070多个血清型多个血清型(serogroupsserogroups),至少有,至少有2020个种可引起人感染。个种可引起人感染。武汉市疾病
5、预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科种名发现时间 种名发现时间 种名发现时间 Legionella pneumophila1979Legionella maceachernii 1985Legionella geestiana 1993Legionella bozemanae 1980Legionella parisiensis 1985Legionella londiniensis 1993Legionella dumoffii 1980Legionella rubrilucens 1985Legionella nautarum 1993Legionella gorma
6、nii 1980Legionella santicrucis 1985Legionella quateirensis 1993Legionella micdadei 1980Legionella spiritensis 1985Legionella worsleiensis 1993Legionella pittsburghensis 1980Legionella steigerwaltii 1985Legionella lansingensis 1994Legionella jordanis 1982Legionella israelensis 1986Legionella lytica 1
7、996Legionella longbeachae 1982Legionella birminghamensis1988Legionella waltersii 1996Legionella oakridgensis 1983Legionella brunensis 1989Legionella taurinensis 1999Legionella wadsworthii 1983Legionella cincinnatiensis1989Legionella beliardensis 2001Legionella feeleii 1984Legionella moravica 1989Leg
8、ionella drozanskii 2001Legionella sainthelensi 1984Legionella quinlivanii 1990Legionella fallonii 2001Legionella anisa 1985Legionella tucsonensis 1990Legionella gresilensis 2001Legionella cherrii 1985Legionella adelaidensis 1991Legionella rowbothamii 2001Legionella erythra 1985Legionella fairfielden
9、sis 1991Legionella busanensis 2003Legionella hackeliae 1985Legionella gratiana 1991Legionella drancourtii 2004Legionella jamestowniensis1985Legionella shakespearei 1992军团菌种军团菌种武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科军团菌病军团菌病武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科Part II:样本的采集与运输武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检
10、验科哪些环境中存在军团菌?武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科标本的种类标本的种类u 环境水标本环境水标本:空调冷却塔水、冷凝水:空调冷却塔水、冷凝水,温泉水温泉水,淋浴水淋浴水,加湿器水;加湿器水;u 病人组织标本病人组织标本:如痰如痰,支气管灌洗液支气管灌洗液,胸水胸水,血液等标本血液等标本。武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科环境标本采集原则 最初最初流出的水标本:打开水龙头或装置后立即采集水流出的水标本:打开水龙头或装置后立即采集水样,该水样即样,该水样即代表代表设备设备内的水内的水。过后流出的水标本:最初流出的水标本收集
11、以后,让过后流出的水标本:最初流出的水标本收集以后,让设备内的水流掉设备内的水流掉后再后再采集水样。此水代表采集水样。此水代表供给设备的供给设备的水水。武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科环境标本采集 有有杀生物剂时的采样:水样中含有氯或其它氧化性杀杀生物剂时的采样:水样中含有氯或其它氧化性杀生物剂时,向生物剂时,向采样瓶采样瓶中添加适量硫代硫酸钾使其灭活。中添加适量硫代硫酸钾使其灭活。对于其它的生物剂,加入普通的对于其它的生物剂,加入普通的中性中性试剂是无效的。试剂是无效的。注意:样本采集到浓缩,以及样本采集到浓缩培养的注意:样本采集到浓缩,以及样本采集到浓缩
12、培养的间隔时间控制在间隔时间控制在14天天以内。样本的来源,数量,有无以内。样本的来源,数量,有无杀虫剂都要登记,并同标本一起送杀虫剂都要登记,并同标本一起送到实验室到实验室。不知来。不知来源或不知道处理过程的水标本是不予进行试验的。源或不知道处理过程的水标本是不予进行试验的。武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科常见几种系统采集部位冷水冷水系统的采集:系统的采集:进水系统进水系统蓄水池蓄水池与每个蓄水池相连的下水道的排出口与每个蓄水池相连的下水道的排出口蓄水池最远的下水道的排出口蓄水池最远的下水道的排出口 对对每一个装置来说,收集每一个装置来说,收集500ML最
13、初流出的水标本,让水持续最初流出的水标本,让水持续流,并流,并在流水在流水中放一只温度计,待温度稳定后,收集中放一只温度计,待温度稳定后,收集500ML过过后流出的水标本。后流出的水标本。武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科热水系统热水系统加热器的排出口:选用保护性的橡胶手套和其它的保护性装备加热器的排出口:选用保护性的橡胶手套和其它的保护性装备关掉离加热器最近的冷水系统。关掉离加热器最近的冷水系统。避免冷热水混合避免冷热水混合加热器的排水口可用火焰或酒精棉球消毒干燥加热器的排水口可用火焰或酒精棉球消毒干燥排水口连接一根干净的硅胶管排水口连接一根干净的硅胶管 采
14、样方式采样方式:打开开关采集最初流出的水标本。让水排掉至温度:打开开关采集最初流出的水标本。让水排掉至温度稳定为止稳定为止。再。再采一份过后流出的标本,并关闭开关采一份过后流出的标本,并关闭开关武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科淋浴器 收集收集最初流出的水标本最初流出的水标本 如果淋浴器有一个大的莲蓬头式喷嘴,用一个干净的如果淋浴器有一个大的莲蓬头式喷嘴,用一个干净的未用过的塑料袋未用过的塑料袋,该,该装置包裹起来,切掉一个角,将装置包裹起来,切掉一个角,将该切口处置于接取标本容器的开口处该切口处置于接取标本容器的开口处武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制
15、中心微生物检验科微生物检验科冷却塔警告警告:为安全起见,采样前,负责供水系统的工作人员应关掉:为安全起见,采样前,负责供水系统的工作人员应关掉冷却塔的鼓风机。戴冷却塔的鼓风机。戴一副一副齐肘的橡胶手套,从池内舀水,由于齐肘的橡胶手套,从池内舀水,由于机器继续运行而不能关闭冷却塔时,则需要机器继续运行而不能关闭冷却塔时,则需要采样采样人员做出专门人员做出专门的安排,这种情况下,应佩戴安全护目镜和呼吸道防护装备。的安排,这种情况下,应佩戴安全护目镜和呼吸道防护装备。在塔的入口处采样:将干净的硅胶管插入瓶内,通过虹吸作用在塔的入口处采样:将干净的硅胶管插入瓶内,通过虹吸作用吸取顶部蓄水池的水吸取顶部
16、蓄水池的水。先。先用水充满管子并夹住其一端,以防止用水充满管子并夹住其一端,以防止管子空了。管的一端放在蓄水池里,另一端管子空了。管的一端放在蓄水池里,另一端放在放在采样瓶里,使采样瓶里,使瓶内管的一端低于蓄水池管的一端。松开夹子,水开始流出,瓶内管的一端低于蓄水池管的一端。松开夹子,水开始流出,取够取够所需所需的量,停止虹吸,将管从蓄水池内取出。的量,停止虹吸,将管从蓄水池内取出。武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科 进水口远处采集池塘内的水:用勺子采取冷却塔,池进水口远处采集池塘内的水:用勺子采取冷却塔,池塘表浅部位的粘塘表浅部位的粘泥(泥(深度深度20cm
17、),用虹吸管采取池,用虹吸管采取池子深处的粘泥。采集位于该系统内子深处的粘泥。采集位于该系统内滤器的滤器的水,沉淀物,水,沉淀物,碎砾等。碎砾等。注意:所需样品的数量取决于该系统内的大小和地理注意:所需样品的数量取决于该系统内的大小和地理位置。如果位置。如果蓄水池和蓄水池和水塔之间的管道短,那么只需采水塔之间的管道短,那么只需采集一份标本。集一份标本。武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科标本的运输和相关生物安全要求标本的运输和相关生物安全要求u在周围环境温度下运送水样标本在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻不必冷冻,但要防止但要防止受热和阳光受热和阳光,标本要
18、尽可能快或最好在两天内送到实标本要尽可能快或最好在两天内送到实验室验室,室温下室温下(21(21+3)3)贮藏在实验室或其他地方。贮藏在实验室或其他地方。u对于临床标本,最好立即做预期实验,如不能马上进对于临床标本,最好立即做预期实验,如不能马上进行,应放在行,应放在-20-20冻存备用冻存备用。武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科军团菌操作生物安全性军团菌操作生物安全性u应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。u生物安全生物安全级实验室,最好在安全柜中操作。级实验室,最好在安全柜中操作。u操作人员培训。操作人员培
19、训。u菌种保存。菌种保存。武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定种或样本运输管理规定病原菌名称病原菌名称危害程度危害程度分类分类实验活动所需生物安全实验室级别实验活动所需生物安全实验室级别运输包装分类运输包装分类学名学名中文名中文名大量活菌大量活菌操作操作动物感动物感染实验染实验样本样本检测检测非感染性非感染性材料实验材料实验A/BUN 编编号号Legionella pneumophila嗜肺军团嗜肺军团菌菌第三类第三类BSL-2ABSL-2BSL-2BSL-1BUN
20、3373武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科Part III:军团菌的分离与检测武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科水样标本中军团菌的分离方法水样标本中军团菌的分离方法检测依据检测依据:公共场所集中空调通风公共场所集中空调通风系统卫系统卫生生规范规范中的集中空调通风系中的集中空调通风系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌的检验方法见菌的检验方法见附录附录B B。适用于各种环境标本军团菌检适用于各种环境标本军团菌检测测 ,包括:,包括:饮用水、工业用饮用水、工业用水、天然水以及一些如沉积物、水、天然水以及一些如沉积
21、物、沉淀物、软泥等物质。沉淀物、软泥等物质。武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科标本肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物水样血清水样处理与制备血清学检测方法:*间接荧光抗体染色法*试管凝集试验*ELISA法接种军团菌BCYE培养基接种军团菌选择性GVPC培养基37,5%CO2,培养3-14天挑可疑菌落革兰氏染色涂片镜检37,5%CO2,培养3-14天革兰氏染色阴性杆菌革兰氏染色阳性杆菌 纯培养 弃去 确认试验 血清玻片凝集试验 PCR检测 生化试验 尿液抗原检测武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科军团菌水质检测概括军团
22、菌水质检测概括1.采样采样2.浓缩浓缩3.培养培养4.分离分离5.鉴定鉴定武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科实验所需仪器设备90mm平皿平皿3537孵箱孵箱滤器(大的不锈钢制成的滤器)滤器(大的不锈钢制成的滤器)正压膜蠕动过滤泵:流速可调。正压膜蠕动过滤泵:流速可调。3升升/分钟分钟注意:样本量少,也可用真空辅助的滤过系统代替注意:样本量少,也可用真空辅助的滤过系统代替膜滤器:膜滤器:0.22um或或0.45um水浴锅:水浴锅:离心机:离心机:涡旋振荡器:涡旋振荡器:显微镜:显微镜:武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科军团菌检测
23、所需准备基本试军团菌检测所需准备基本试剂剂1.1.培养基(培养基(GVPCGVPC,BCYE,BCYE-CYS)BCYE,BCYE-CYS)2.2.试剂试剂 (生化试剂、甲醛的盐溶液)生化试剂、甲醛的盐溶液)3.3.酸缓冲液(酸缓冲液(0.2mol/L KCL-HCL),碱缓冲液,碱缓冲液(0.03mol/L KOH)4.4.血清学试剂血清学试剂武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科培养检测所需准备材料培养检测所需准备材料1.1.直径大约为直径大约为90mm90mm或或100mm100mm的无菌培养皿的无菌培养皿2.2.培养箱,培养箱,COCO2 2能够恒温保持在
24、(能够恒温保持在(36361 1)。3.3.水浴箱,能够保持在(水浴箱,能够保持在(50501 1)4.4.显微镜或荧光显微镜。显微镜或荧光显微镜。武汉市疾病预防控制中心武汉市疾病预防控制中心微生物检验科微生物检验科样品采样准备材料样品采样准备材料1.1.玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶:灭菌处理。水样一般采集玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶:灭菌处理。水样一般采集为为250-500ml250-500ml,收集在容器瓶中。,收集在容器瓶中。2.2.如果所用的容器,如聚乙烯瓶,不能高压,可用流动的热如果所用的容器,如聚乙烯瓶,不能高压,可用流动的热水(不低于水(不低于7070)或蒸汽进行巴斯德氏消毒,时间不
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