非小细胞肺癌基因检测课件.pptx
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- 关 键 词:
- 细胞 肺癌 基因 检测 课件
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1、非小细胞肺癌基因检测非小细胞肺癌基因检测1前言随着分子医学进展和靶向药物的不断涌现,晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗已进入到个体化治疗的时代。目前临床应用的个体化靶向治疗主要针对EGFR突变型和ALK融合基因型肺癌,这两种基因变异型肺癌均具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物,临床疗效得到明显提高。2EGFREGFR突变检测中需要明确的几个基本概念突变检测中需要明确的几个基本概念2 2、基因突变是指、基因突变是指DNADNA发生碱基序列的改变:发生碱基序列的改变:须选择有针对性的检测手段,针对非DNA的检测手段如:RT-PCR(检测RNA表达),免疫组化(检测蛋白表达)以及针对非
2、碱基序列的检测手段如:FISH(检测DNA的扩增、缺失、断裂、融合)等,均不适用。体细胞突变体细胞突变发生在非种系组织中不具有遗传性不会遗传给子代种系突变种系突变发生于精子或卵子中可以遗传子代子代所有细胞均带突变1 1、EGFREGFR突变为体细胞突变:突变为体细胞突变:发生于肿瘤细胞中,正常细胞(癌旁或白细胞等)不含突变。要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测,这是保证检测结果可靠的根本前提。3 EGFREGFR基因突变检测概念基因突变检测概念EGFR突变检测指肿瘤组织中编码EGFR基因的DNA突变状态检测并不是:EGFR基因DNA拷贝数的检测(FISH法)EG
3、FR蛋白表达量的检测(IHC法)。EGFR检测检测检测物质检测物质部位部位方法方法基因突变DNA细胞核测序法、ARMS法等拷贝数DNA细胞核荧光原位杂交法(FISH)蛋白表达蛋白质细胞膜免疫组化法(IHC)RNA表达RNA细胞核RT-PCRX4Nature Review 2007,7:169NSCLCNSCLC中中EGFREGFR酪氨酸激酶区突变酪氨酸激酶区突变种类种类56标本采集及病理评估DNA 抽提及质控检测报告EGFR突变检测ARMS测序法其它方法EGFR 突变检测流程突变检测流程7EGFREGFR突变检测中的相关角色突变检测中的相关角色患者患者临床医生临床医生胸外科医师胸外科医师内镜医
4、师内镜医师收集肺癌组织标本收集肺癌组织标本病理科医生病理科医生准备样本准备样本实验操作及结果分析实验操作及结果分析实验室人员实验室人员报告结果给临床医生报告结果给临床医生-肿瘤科医生肿瘤科医生-放疗科医生放疗科医生-呼吸科医生呼吸科医生8用于用于EGFR突变检测的标本突变检测的标本 肿瘤组织肿瘤组织目前最可靠的标本;目前最可靠的标本;其它样本:外周血(血浆、血清)细胞学(胸水、痰液细胞学)支气管刮取物 仍需进一步研究确定这些样本在临床实践及诊断中的应用9标本问题l 石蜡组织:尽可能送检一年内的石蜡标本。石蜡切片:含肿瘤细胞越多越好(50%以上);组织部位面积约6mm x 6mm以上;包埋组织:
5、组织块不小于0.50.50.5(cm)。l 新鲜组织:比石蜡等处理过的旧组织,DNA保存得更完整,对PCR实验更有利,但一定要经病理学确认。含有肿瘤组织50%以上;重量10g(约米粒大小以上),经PBS或生理盐水冲洗干净。取癌组织的中心位置组织块(避开坏死区域),固定于10%中性福尔马林溶液中,尽快送病理科。l 细胞学标本:可用l 原发灶与复发灶:只要能获得足够的癌细胞,均可;但对于复发的患者,再次活检不仅可确诊,还可以获得分子标志物的进一步信息。10标本因素标本因素对对EGFR突变检测的影响突变检测的影响-肿瘤组织特点肿瘤组织特点-遗传异质性遗传异质性 对检测方法敏感度有较高要求对检测方法敏
6、感度有较高要求正常细胞混杂正常细胞混杂11标本因素标本因素对对EGFR突变检测的影响突变检测的影响-组织标本种类组织标本种类-对检测方法有对检测方法有相应相应要求要求,组织标本及,组织标本及DNADNA质控尤其重要质控尤其重要 冰冻新鲜组织冰冻新鲜组织 固定包埋组织固定包埋组织-外科手术标本完整,量多广泛-小活检标本完整,量少受限-外科手术标本片段化,量多受限-小活检标本片段化,量少极度受限DNA质与量质与量适用方法适用方法12图4.EGFR基因检测使用的临床样本及其操作。基因检测使用的临床样本及其操作。A.被切成被切成10微米的石蜡包埋标本。微米的石蜡包埋标本。B.在支气管镜下将刷检样本放在
7、生理盐水中洗净(悬浮),可以就这样冷冻保存,在支气管镜下将刷检样本放在生理盐水中洗净(悬浮),可以就这样冷冻保存,C.进一步将该生理盐水液离心,沉淀溶解于进一步将该生理盐水液离心,沉淀溶解于AL缓冲液,缓冲液,此状态此状态可以室温保存。可以室温保存。13肿瘤组织标本的采集及病理评估肿瘤组织标本的采集及病理评估肿瘤组织标本病理学评估组织切片非小细胞性肺癌诊断及类型肿瘤细胞比例肿瘤细胞总数标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤细胞H&E 染色片用于病理评估白片用于提取DNA建议最少切片数:-手术标本,5 m X4-小活检标本,5 m X8 组织标本来源组织标本来源手术标本支气管下活检经皮穿刺活检 标本处理及贮
8、存标本处理及贮存新鲜冻存:液氮或-80CFFPE14检测方法目前 EGFR 基因突变的检测方法很多DNA 直接测序法应用广泛,可检测已知的突变和未知的突变,但对标本的肿瘤细胞含量要求较高,一般要求标本中肿瘤细胞的比例在 50%以上,至少不低于 30%。基于实时荧光定量 PCR 基础上的方法(如 ARMS 法)较直接测序法更加敏感,可检测样品中 1.0%0.1%的突变基因,更适合用于肿瘤细胞含量较少的小标本检测。ARMS 方法操作简单,是目前临床上较常用的方法之一,但只能检测已知的突变,且标本需进行预处理,检测费用较高。15直接测序法直接测序法流程及数据分析流程及数据分析PCR*纯化纯化测序反应
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