流式细胞检测课件.ppt

1、中新口腔王丽2015-07-07流式细胞技术流式细胞技术FLOW CYTOMETRY中新口腔What does it mean?CYTOCellMeasure(ment)METRY2FLOW CYTOMETRY：在液流系统中，快速测定单个细胞或微粒的物理特性和生化特性的方法。Flow Cytometer(FCM)流式细胞仪流式细胞仪Flow Sorter 流式细胞分选仪流式细胞分选仪中新口腔BD BD FACSVantageFACSVantageBD BD CaliburCalibur 流式细胞仪流式细胞仪3BECKMANBECKMAN CytoFLEXCytoFLEXMiltenyiMilt

2、enyi MACSQuantMACSQuantGuava 5HT Guava 5HT 微毛细管细胞分析仪微毛细管细胞分析仪中新口腔 流式细胞仪的组成流式细胞仪的组成OpticsElectronicsSoftwareFluidicsWaste4中新口腔样品规格：样品规格：96孔板孔板 或或 1.5 mL 小管小管5进样准备中新口腔工作流程v样本制备样本制备v荧光染色荧光染色v上样检测上样检测v数据分析数据分析FluorescenceDetectorHistogramSingle Cell SuspensionCellSuspensionFluorescentlyLabelledAntibodyF

3、luorescenceY+Blue Laser(488 nm)6中新口腔 液流系统液流系统功能：传送待测样本中的细胞到激光照射区。功能：传送待测样本中的细胞到激光照射区。样本：样本：0.2-1500.2-150微米的粒子，最快可在微米的粒子，最快可在1 1秒种内计测数万个细胞。秒种内计测数万个细胞。Sheath Fluid:10 mL/TestWaste：1L/hr run10万万100万万cells/TestNo Sheath FluidWaste：500 nmSP 500=PE APC PE PerCPPerCP FITC FITC PE较强，适用于弱表达抗原较强，适用于弱表达抗原 FIT

4、C最便宜，适用于强表达抗原最便宜，适用于强表达抗原21中新口腔常见荧光物质的应用PM1(Orange)Add nmPM2(Red)PM3(Green)Fluorophores Conjugated to an AbPEPE-Cy5FITCDead Cell Dyes(DNA staining)PI7-AADLive Cell Dye(DNA Staining)LDS751Fluorescent ProteinsGFPCell Tracking DyesCFSE中新口腔直方图和点阵图直方图(Histogram Plot(Histogram Plot)单参数分析.X-Axis:荧光信号强度.Y-A

5、xis:细胞数目.点阵图(Dot Plot(Dot Plot)双参数分析.X and Y axis：两种荧光信号强度.每个点代表一个细胞.Log&Lin:荧光强度的坐标可以是线性的，也可以是对数的荧光强度的坐标可以是线性的，也可以是对数的.中新口腔直方图：可根据单一因素区分细胞亚群10e010e110e210e310e4CD20-FITC(GRN-HLog)70 53 35 18 0CountM2M110e010e110e210e310e4CD20-FITC(GRN-HLog)70 53 35 18 0Count70 cells each have a green fluorescence i

6、ntensity of about 400Notice the subpopulation?中新口腔25血细胞分群（红细胞溶解后（红细胞溶解后）点阵图：根据多因素区分细胞亚群点阵图：根据多因素区分细胞亚群中新口腔荧光补偿光谱重叠的校正光谱重叠的校正：目前使用的荧光染料都是宽波谱，两两之间的发射谱范围有一定的重叠。为了克服这种误差，可使用荧光补偿电路，设置合理的荧光信号补偿。中新口腔我需要准备什么？1.Why：为什么进行流式细胞检测？流式细胞技术是否是最佳的检测方法？检测的原理是什么？要检测的物质是什么？2.Where：荧光标记的物质在哪里？是否需要对细胞进行固定？打孔？3.Which：选择什么

7、荧光标记物？4.How:样品制备流程，多少个标本？（空白对照、阴性对照）5.When:预约（175874947群共享下载申请表）Do it！（合适的细胞密度并避免细胞结团）27中新口腔28应用范围中新口腔实验对照的设计实验对照的设计 空白对照空白对照 ALLALL ：采用不标记的细胞进行平行测定，用于确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。阴性对照：阴性对照：调节各荧光探测器合适的放大倍数，即确定待测标本的基础荧光域值。常用同型对照（与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同亚型的免疫球蛋白），用于消除抗体与细胞非特异性结合产生的背景。阳性对照：阳性对照：用已知表达某种抗原的细胞（

8、阳性细胞）进行平行实验，通常用于检测抗体是否正常或确定实验方法的稳定性和准确性。补偿对照：补偿对照：多色分析时，将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本进行单色标记，以测定荧光信号的光谱重叠情况以进行调节。单色分析：单色分析：设同型抗体对照 多色分析：多色分析：同型对照，补偿对照29中新口腔细胞周期：细胞周期：从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。（细胞内的 DNA 含量随细胞周期进程发生周期性变化。）DNA 含量：含量：G1（DNA 合成前期，2C）、分裂间期 S （DNA 合成期，2C-4C）、G2（DNA 合成后期，4C）分裂期 M期（DNA 为 4C）。利用核酸标

9、记的方法，通过流式细胞仪对细胞内 DNA 的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。但是分裂期（M期）的前期、中期、后期、末期四个时期，普通流式无法进行定量检测。301.DNA细胞周期分析细胞周期分析应用实例应用实例中新口腔1.DNA细胞周期分析细胞周期分析31中新口腔实验步骤及注意事项：1、细胞周期固定：加 200ul 细胞（贴壁培养的细胞需要先用胰酶消化）到 1.5ml 离心管中300g 转速离心 5min，并用 1PBS 清洗一次离心去上清 添加300ul PBS 溶解沉淀细胞缓慢加入缓慢加入20预冷的预冷的100%乙醇乙醇700ul 固定细胞（固定过程中需要边滴加乙醇，边震荡，

10、不要产生细胞聚团，否则会严重影响实验结果）最后乙醇终浓度为 70%20孵育至少 3 小时（建议 4孵育过夜，效果会更好）。2、将固定好的细胞 300g 转速离心 5min，并用 1PBS 清洗一次。将细胞用 200ul的 Guava 细胞周期试剂重新悬浮，室温孵育 30min，注意避光。3、用200目细胞筛过滤细胞（如果使用PI染色必须过滤），显微镜下细胞无结团，Guava 流式细胞仪检测。321.DNA细胞周期分析细胞周期分析中新口腔2.2.早期细胞凋亡检测早期细胞凋亡检测33中新口腔2.2.早期细胞凋亡检测结果早期细胞凋亡检测结果34正常细胞：Annexin V(-)/7-AAD(-)早期

11、凋亡细胞：Annexin V(+)/7-AAD(-)晚期凋亡细胞：Annexin V(+)/7-AAD(+)CD95/FASL CD95/FASL 刺激诱导凋亡刺激诱导凋亡中新口腔实验步骤 1.样本准备(贴壁细胞)：弃去培养细胞(对数生长期)中的旧培养液，加入胰酶消化细胞，。收集旧培养基，通过离心获得凋亡或收集旧培养基，通过离心获得凋亡或死亡死亡细胞细胞，与之后消化后的细胞混合，再检测，与之后消化后的细胞混合，再检测。2.细胞染色：在 96-well 微孔板相应的孔中加入 100ulGuava Nexin（货号：4500-0450）和100ul 准备好的细胞悬液，室温避光孵育 20min；尽快

12、用流式细胞仪获取结果（1h 内）。3.流式细胞仪检测获取数据。注意：实验最好包括实验组、阴性对照和阳性对照（凋亡诱导组）。352.2.早期细胞凋亡检测结果早期细胞凋亡检测结果中新口腔细胞凋亡细胞凋亡是动态事件，在不同时期展现不同的凋亡信号。早期早期磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）暴露在细胞膜上，与 PS 结合的 Annexin V 成为检测凋亡早期的最常用指标。除此之外，线粒体膜电位变化和细胞色素 C 的释放，也被认为是凋亡的早期信号。中期中期Caspase 家族蛋白分布于各条凋亡通路上，是中期凋亡的指标。活化 Caspase 蛋白检测可以使用 FLICA 底物。晚期

13、晚期DNA 片段化是凋亡晚期的显著特征。通过 TUNEL 法对断裂的 DNA 片段进行标记。36中新口腔凋亡的途径Caspase-8 外源性外源性TNF-alpha/FAS 受体Response to environmental cuesCaspase-9 内源性内源性细胞色素C的释放DNA损伤或细胞周期阻滞Caspase-3/7 关键的执行蛋白MultiCaspasecaspases 1,3,4,5,6,7,8&9 的检测Caspase家族蛋白酶是细胞程序性死亡过程中心点。家族蛋白酶是细胞程序性死亡过程中心点。中新口腔Guava Incyte IC50/EC50 自动分析l IC50 即半数抑制浓度，是指一种药物能将细胞生长、病毒复制等抑制 50%所需的浓度。l EC50 即半数效应浓度，是指引起受试对象 50%个体产生一种特定效应的药物剂量。使用 Guava Incyte 软件，可以自动进行 IC50/EC50 计算和曲线绘制。38中新口腔39抗体表达抗体表达 多样本单指标检测多样本单指标检测中新口腔40+抗体表达抗体表达 多指标检测多指标检测中新口腔41