毛细管电泳学习培训模板课件.ppt

1、4.5 毛细管电泳毛细管电泳 毛细管电泳毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)又称又称为高效毛细管电泳为高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE),是近年来发展最快的分析是近年来发展最快的分析方法之一。毛细管电泳技术是一类以毛细管为分方法之一。毛细管电泳技术是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，根据样品中离通道，以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术，它使分析技术从微升分离的一类液

2、相分离技术，它使分析技术从微升水平进入纳升水平，并使细胞分析，乃至单分子水平进入纳升水平，并使细胞分析，乃至单分子分析成为可能。分析成为可能。传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热，焦耳热，1967年年Hjerten最先提出在直径为最先提出在直径为3 mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳。现代毛细的毛细管中做自由溶液的区带电泳。现代毛细管电泳技术是由管电泳技术是由Jorgenson和和Lukacs在在1981年首年首先提出，他们使用了先提出，他们使用了75 mm的毛细管柱，用荧光的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。检测器对多种组分实现

3、了分离。1984年年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支：胶束电动毛细管色谱。重要分支：胶束电动毛细管色谱。1987年年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年，毛细管内进行。同年，Cohen发表了毛细管凝胶发表了毛细管凝胶电泳的工作。近年来，将液相色谱的固定相引入电泳的工作。近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了毛细管电色谱，扩大了毛细管电泳中，又发展了毛细管电色谱，扩大了电泳的应用范围。毛细管电泳技术兼有高压电泳电泳的应用范围。毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色

4、谱等优点，其突出特点是：及高效液相色谱等优点，其突出特点是：（1）它是在内径）它是在内径10200 m的石英毛细管中的石英毛细管中进行的，在毛细管中的散热性好，沿着管截面的进行的，在毛细管中的散热性好，沿着管截面的温度梯度很小，因此，可以提高加在毛细管两端温度梯度很小，因此，可以提高加在毛细管两端的工作电压，所加电压可达几十千伏。的工作电压，所加电压可达几十千伏。（2）不需要阻流介质，但可使用凝胶（或大分子介）不需要阻流介质，但可使用凝胶（或大分子介质）作分子筛介质。质）作分子筛介质。（3）使用在线柱检测法，缩短分析时间，结合计算）使用在线柱检测法，缩短分析时间，结合计算机处理数据，实现自动化

5、操作。机处理数据，实现自动化操作。（4）灵敏度高，检测方式多，检测器除了未能和原）灵敏度高，检测方式多，检测器除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外子吸收及红外光谱连接以外,其它类型检测器均已其它类型检测器均已和和CE实现了连接检测。检测限可达实现了连接检测。检测限可达10-1310-15 mol，使用激光诱导的荧光检测限可达使用激光诱导的荧光检测限可达10-1910-21 mol。（5）分辨率高，理论塔板数为每米几十万至几百）分辨率高，理论塔板数为每米几十万至几百万。万。（6）取样量少，有时只需几个纳升，流动相只需）取样量少，有时只需几个纳升，流动相只需几毫升，实验成本低、消耗少。几毫升，实验

6、成本低、消耗少。（7）操作模式多，开发分析方法容易，应用范围）操作模式多，开发分析方法容易，应用范围极广。极广。毛细管电泳技术可检测多种样品，如血清、血毛细管电泳技术可检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织及其实浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织及其实验动物活体实验；且可分离分析多种组分，如核验动物活体实验；且可分离分析多种组分，如核酸酸/核苷酸、蛋白质核苷酸、蛋白质/多肽多肽/氨基酸、糖类氨基酸、糖类/糖蛋白、糖蛋白、酶、碱氨基酸、微量元素、维生素、杀虫剂、染酶、碱氨基酸、微量元素、维生素、杀虫剂、染料、小的生物活性分子等的快速分析，以及料、小的生物活性分子等的快速分

7、析，以及DNA序列分析和序列分析和DNA合成中产物纯度测定等，甚至可合成中产物纯度测定等，甚至可用于碱性药物分子及其代谢产物、无机及有机离用于碱性药物分子及其代谢产物、无机及有机离子子/有机酸、单细胞分析、药物与细胞的相互作用有机酸、单细胞分析、药物与细胞的相互作用和病毒的分析，如在缓冲液中加入表面活性剂则和病毒的分析，如在缓冲液中加入表面活性剂则可用于手性分离中性化合物。由于技术本身优势可用于手性分离中性化合物。由于技术本身优势以及分离生物大分子的能力以及分离生物大分子的能力,使使CE成为常用分析成为常用分析方法之一。方法之一。EveveE4.5.1 毛细管电泳的基本原理毛细管电泳的基本原理

8、 一、电泳淌度一、电泳淌度 毛细管电泳分离是基于组分固有的淌度不同，毛细管电泳分离是基于组分固有的淌度不同，在电场作用下形成不同迁移速度而进行的。一在电场作用下形成不同迁移速度而进行的。一个离子在电场下的迁移速度为：个离子在电场下的迁移速度为：式中式中 为为离子移动速度，离子移动速度，为电泳淌度为电泳淌度,为电为电场强度。场强度。电泳淌度是一常数。半径小、电荷大电泳淌度是一常数。半径小、电荷大的离子具有较大的电泳淌度；而半径大、电荷的离子具有较大的电泳淌度；而半径大、电荷小的离子具有较小的电泳淌度。电泳淌度的差小的离子具有较小的电泳淌度。电泳淌度的差异，构成了电泳分离的基础。异，构成了电泳分离

9、的基础。二、电渗二、电渗 电渗或电渗流电渗或电渗流(electroomotic flow,EOF)是指是指管内溶液在电场作用下整体朝一个方向运动的现管内溶液在电场作用下整体朝一个方向运动的现象象,可控制组分的迁移速度和方向，进而影响毛可控制组分的迁移速度和方向，进而影响毛细管电泳的分离模式、分离进程和分离重现性等。细管电泳的分离模式、分离进程和分离重现性等。对于石英毛细管来说，对于石英毛细管来说，pH3情况下，由于硅情况下，由于硅醇基（醇基（SiOH）电离成）电离成SiO-，使管壁表面带负电，使管壁表面带负电，为了保持电荷平衡，溶液中水合离子（一般为阳为了保持电荷平衡，溶液中水合离子（一般为阳

10、离子）被吸附到表面附近，形成双电层。在高电离子）被吸附到表面附近，形成双电层。在高电压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动。如图地朝负极方向移动。如图4.3所示。所示。图图4.3 电渗产生示意图电渗产生示意图粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流电渗流(EOF)两种速度的矢量和。两种速度的矢量和。正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为出；中性粒子的电泳流速度为“零零”，故其迁移，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运

11、动方向和电速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，这样因各流速度，故它将在中性粒子之后流出，这样因各种粒子迁移速度不同而实现分离。种粒子迁移速度不同而实现分离。电渗是区带毛细管电泳中推动流体前进的驱动力，电渗是区带毛细管电泳中推动流体前进的驱动力，它使整个流体像一个塞子一样以均匀的速度向前它使整个流体像一个塞子一样以均匀的速度向前运动，使整个流型呈近似扁平型的运动，使整个流型呈近似扁平型的“塞式流塞式流”。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。它使溶质区带在毛细管内原则上不会

12、扩张。但在高效液相色谱（但在高效液相色谱（HPLC）中，采用的压力驱动方式使中，采用的压力驱动方式使柱中流体呈抛物线型，其中柱中流体呈抛物线型，其中心处速度是平均速度的两倍，心处速度是平均速度的两倍，导致溶质区带本身扩张，引导致溶质区带本身扩张，引起柱效下降，使其分离效率起柱效下降，使其分离效率不如不如CE。图。图4.4为毛细管电为毛细管电泳电渗流和高效液相液体流泳电渗流和高效液相液体流的比较，这是毛细管电泳获的比较，这是毛细管电泳获得高效分离的重要原因之一。得高效分离的重要原因之一。图图4.4 电渗流与液相色谱流电渗流与液相色谱流 比较示意图比较示意图电渗的大小可用电渗的大小可用电渗速度电渗

13、速度或或电渗淌度电渗淌度来表示：来表示：Eveo （4.16）eo （4.17）eov式中式中 为电渗速度，为电渗速度，为电渗淌度，为电渗淌度，为双电层为双电层的的Zeta电位，电位，为分离介质的介电常数。为分离介质的介电常数。eo电渗淌度与硅氧层表面的电荷密度成正比，与离子电渗淌度与硅氧层表面的电荷密度成正比，与离子强度的平方根成反比。在低强度的平方根成反比。在低pH条件下，硅氧层形条件下，硅氧层形成分子（成分子（Si-OH），因而减少了表面电荷密度，故），因而减少了表面电荷密度，故电渗速度减小。如在电渗速度减小。如在pH 9的硼砂缓冲液中电渗速的硼砂缓冲液中电渗速度约度约2 mm s-1，

14、而在，而在pH 3介质中电渗速度减小约一介质中电渗速度减小约一个数量级。影响电渗的一个重要因素是毛细管中因个数量级。影响电渗的一个重要因素是毛细管中因电流作用产生的焦耳热，能使得柱中心的温度高于电流作用产生的焦耳热，能使得柱中心的温度高于边缘的温度，边缘的温度，形成抛物线型的温度梯度，管壁附近形成抛物线型的温度梯度，管壁附近 温度低，中心温度高，结果使电渗速度不均匀而温度低，中心温度高，结果使电渗速度不均匀而造成区带变宽，分离效率降低。为此，应避免使造成区带变宽，分离效率降低。为此，应避免使用过长和内径大于用过长和内径大于50m 的毛细管柱，还应注意减的毛细管柱，还应注意减小毛细管的壁厚、选择

15、适宜的电压和缓冲液及使小毛细管的壁厚、选择适宜的电压和缓冲液及使用良好的冷却系统。用良好的冷却系统。CE 中观察到的离子淌度是离子的电泳淌度中观察到的离子淌度是离子的电泳淌度ep和溶液的电渗淌度的矢量和。定义和溶液的电渗淌度的矢量和。定义表观淌度表观淌度为为app，则则eoepapp根据以上的讨论，带正电荷的离子的根据以上的讨论，带正电荷的离子的ep0，eo0，故故app总是为正号，离子向阴极移动；而带负电荷总是为正号，离子向阴极移动；而带负电荷的离子受电泳流的影响被阴极排斥，的离子受电泳流的影响被阴极排斥，ep0，在高，在高pH条件下，若条件下，若eoep，app仍为正号，离子仍然可仍为正号

16、，离子仍然可向阴极移动，但在低向阴极移动，但在低pH条件下，条件下，app可为负号，离可为负号，离子将向反方向移动。此时必须改变电场方向，方可子将向反方向移动。此时必须改变电场方向，方可检测到欲分析的离子。检测到欲分析的离子。对于实际淌度为对于实际淌度为net（net 指指 net speed）的组）的组分，表观淌度可由下式计算：分，表观淌度可由下式计算：tVtLdnetEapp（4.19）式中式中Ld：从进样口到检测器的实际柱长；：从进样口到检测器的实际柱长；V：电压；：电压；t：所需的分析时间。：所需的分析时间。实际测试电渗淌度时可用中性组分，此时实际测试电渗淌度时可用中性组分，此时ep=

17、0,eo=app,上式为：上式为：tVtLdEeo中性（4.20）CE的毛细管容易冷却，故可以使用的毛细管容易冷却，故可以使用2030 KV的高电压，由于管内径只有的高电压，由于管内径只有25100 m，无涡流扩，无涡流扩散，使传质阻抗趋于零，因此，有很高的分辨率。散，使传质阻抗趋于零，因此，有很高的分辨率。电解质液由毛细管阳极端进入毛细管，携带被分离电解质液由毛细管阳极端进入毛细管，携带被分离的组分可以从毛细管阴极端流入检测器的比色池，的组分可以从毛细管阴极端流入检测器的比色池，电泳过程与结果分析均容易自动化。因此电泳过程与结果分析均容易自动化。因此CE已成已成为效率极高的现代分析仪器，在生

18、物化学与分子生为效率极高的现代分析仪器，在生物化学与分子生物学中得到日益广泛的应用。物学中得到日益广泛的应用。电渗流的另一个特点是可以使几乎所有的样品组分电渗流的另一个特点是可以使几乎所有的样品组分不管带电不带电、电荷大小、带负电还是带正电都不管带电不带电、电荷大小、带负电还是带正电都以同样的方向移动。各自组分在毛细管中的流出时以同样的方向移动。各自组分在毛细管中的流出时间（迁移时间）取决于电渗流速度和组分电泳速度间（迁移时间）取决于电渗流速度和组分电泳速度的矢量和。在一般情况下，电渗流方向从阳极到阴的矢量和。在一般情况下，电渗流方向从阳极到阴极，且电渗速度大于电泳速度，所以阴离子（除无极，且

19、电渗速度大于电泳速度，所以阴离子（除无机离子）也在阴极流出。因此，合理地利用电渗流机离子）也在阴极流出。因此，合理地利用电渗流可以使阳离子、中性分子、阴离子实现同时分离分可以使阳离子、中性分子、阴离子实现同时分离分析。析。电渗流的控制：电渗流是毛细管电泳中的基本操作电渗流的控制：电渗流是毛细管电泳中的基本操作要素，为了优化分离条件，往往需要控制电渗流。要素，为了优化分离条件，往往需要控制电渗流。控制电渗流最基本的方法有控制电渗流最基本的方法有：电压增加，：电压增加，EOF 增加；缓冲溶液的增加；缓冲溶液的pH增加，增加，EOF 增加；缓冲增加；缓冲溶液的离子强度越大，浓度越高，溶液的离子强度越

20、大，浓度越高，EOF 越大；越大；粘度越小粘度越小EOF的速度或淌度越大；温度越高，的速度或淌度越大；温度越高，EOF越大；在缓冲溶液中加有机越大；在缓冲溶液中加有机/无机改性剂；无机改性剂；改变毛细管内壁的表面电荷。改变毛细管内壁的表面电荷。三、毛细管与焦耳热三、毛细管与焦耳热 在内径很细的毛细管中进行电泳分离与传统在内径很细的毛细管中进行电泳分离与传统电泳比较，主要是减少了焦耳热的影响。焦耳热电泳比较，主要是减少了焦耳热的影响。焦耳热会引起电泳分离介质的温度梯度、粘度梯度和速会引起电泳分离介质的温度梯度、粘度梯度和速度梯度，从而引起区带展宽。毛细管允许高电场度梯度，从而引起区带展宽。毛细管

21、允许高电场下电泳分离，但焦耳热的产生使高电场的使用受下电泳分离，但焦耳热的产生使高电场的使用受到限制。到限制。高场强导致电流增加，引起毛细管中电高场强导致电流增加，引起毛细管中电解质产生焦耳热解质产生焦耳热(自热自热)。自热将使流体在径向产生抛物线型温度分布，即管自热将使流体在径向产生抛物线型温度分布，即管轴中心温度要比近壁处温度高。因溶液粘度随温度轴中心温度要比近壁处温度高。因溶液粘度随温度升高呈指数下降，温度梯度使介质粘度在径向产生升高呈指数下降，温度梯度使介质粘度在径向产生梯度，从而影响溶质迁移速度，使管轴中心的溶质梯度，从而影响溶质迁移速度，使管轴中心的溶质分子要比近管壁的分子迁移得更

22、快，造成谱带展宽，分子要比近管壁的分子迁移得更快，造成谱带展宽，分离效率下降。一般来说温度每提高分离效率下降。一般来说温度每提高1，将使淌，将使淌度增加度增加2%。焦耳热和温度梯度的控制方法：降低电压；焦耳热和温度梯度的控制方法：降低电压；降低离子强度；降低缓冲溶液浓度；减小毛降低离子强度；降低缓冲溶液浓度；减小毛细管内径；采用毛细管温控系统。细管内径；采用毛细管温控系统。四、分离效率和分离度四、分离效率和分离度 分子扩散与理论塔板数分子扩散与理论塔板数：在：在CE中，仅存在纵中，仅存在纵向扩散，扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离向扩散，扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子

23、的依据。沿用色谱的理效率高，分离生物大分子的依据。沿用色谱的理论塔板数来表示电泳分离效率，则论塔板数来表示电泳分离效率，则 2)(lN （4.21）Nl式中式中 为分离效率，为分离效率，为毛细管有效长度。为毛细管有效长度。2=2Dt，实际的分离效能理论塔板数可以直接从电泳谱实际的分离效能理论塔板数可以直接从电泳谱图中求得：图中求得：221)(54.5WtNm式中式中tm为迁移时间，为迁移时间，W1/2为半峰宽度。为半峰宽度。分离度分离度：与色谱分离一样，用峰分离度可以表：与色谱分离一样，用峰分离度可以表示电泳分离质量的好坏。示电泳分离质量的好坏。221apap平均分离度分离度R定义为：定义为：

24、DLVLRefap平均177.0影响分离度的主要因素：工作电压影响分离度的主要因素：工作电压V，毛细管有，毛细管有效长度与总长度比，有效淌度差。效长度与总长度比，有效淌度差。（4.23）（4.24）分离度可按谱图直接由下式计算：分离度可按谱图直接由下式计算：2/)(2112WWttRmm式中式中tm1、tm2为两个组分为两个组分迁移时间，迁移时间，W分别代表两分别代表两个组分峰底宽度。个组分峰底宽度。（4-25）4.5.2 毛细管电泳的仪器与操作毛细管电泳的仪器与操作 毛细管电泳仪器主要包括进样系统、毛细管、毛细管电泳仪器主要包括进样系统、毛细管、高压电源、缓冲液池、检测器和数据处理系统，高压

25、电源、缓冲液池、检测器和数据处理系统，如图如图4.5所示。所示。图图4.5 毛细管电泳仪结构示意图毛细管电泳仪结构示意图一、进样技术一、进样技术 在毛细管电泳中常采用的进样方式为电迁移进在毛细管电泳中常采用的进样方式为电迁移进样和流体动力学进样，如图样和流体动力学进样，如图4.6所示。为了保持高效所示。为了保持高效率，取样体积应控制在率，取样体积应控制在10 ml以内，进样体积对毛以内，进样体积对毛细管电泳效率有显著影响。减少注入管内的样液体细管电泳效率有显著影响。减少注入管内的样液体积，将会增加分离效率。一般说来，样品组分带所积，将会增加分离效率。一般说来，样品组分带所占管长应少于总管长的占

26、管长应少于总管长的1%2%。电迁移进样电迁移进样 进行电迁移法注样时，将含样品液的储瓶代进行电迁移法注样时，将含样品液的储瓶代替一端的缓冲液储瓶，并通过样液瓶引入高压电，替一端的缓冲液储瓶，并通过样液瓶引入高压电，电路按一定的时间周期接通，一般是几秒钟接通电路按一定的时间周期接通，一般是几秒钟接通一次，以使得进入毛细管的样品区带变窄。然后一次，以使得进入毛细管的样品区带变窄。然后断电，并将缓冲储瓶代替样液瓶，再通入高压电，断电，并将缓冲储瓶代替样液瓶，再通入高压电，使电泳过程开始。为使电压沿管线分布均匀，应使电泳过程开始。为使电压沿管线分布均匀，应使样液与缓冲液有相近的电导率。使样液与缓冲液有

27、相近的电导率。电动进样对毛细管内的填充介质没有特别限制，电动进样对毛细管内的填充介质没有特别限制，属普适性方法，可实现完全自动化操作，也是商属普适性方法，可实现完全自动化操作，也是商品仪器必备的进样方法。不过电动进样对离子组品仪器必备的进样方法。不过电动进样对离子组分存在进样偏向，即迁移速度大者多进，小者少分存在进样偏向，即迁移速度大者多进，小者少进或不进，这就是所谓的进样歧视现象，这种现进或不进，这就是所谓的进样歧视现象，这种现象会降低分析的准确性和可靠性。象会降低分析的准确性和可靠性。图图4.6 毛细管电泳仪进样方式示意图毛细管电泳仪进样方式示意图 流体动力学进样流体动力学进样压力进样也叫

28、流动进样，它要求毛细管中的填充压力进样也叫流动进样，它要求毛细管中的填充介质具有流动性，比如溶液等。当将毛细管的两介质具有流动性，比如溶液等。当将毛细管的两端置于不同的压力环境中时，管中溶液即能流动，端置于不同的压力环境中时，管中溶液即能流动，将进样带入。在仪器的实际设计过程中，一般又将进样带入。在仪器的实际设计过程中，一般又分为正向压力进样和负向的真空或虹吸进样三种分为正向压力进样和负向的真空或虹吸进样三种方式。可用三种方法产生：正压、负压方式。可用三种方法产生：正压、负压(管尾抽吸管尾抽吸)或重力或重力(虹吸虹吸)，压力取值一般在，压力取值一般在3450Pa(0.5psi)附近。附近。进样

29、时间的取值在进样时间的取值在15s之间，有时可超过之间，有时可超过60s。利。利用压缩空气如钢瓶气可以实现正压进样，并能和毛用压缩空气如钢瓶气可以实现正压进样，并能和毛细管清洗系统共享，多为商品仪器采用。负压进样细管清洗系统共享，多为商品仪器采用。负压进样需要特别精密的控制设计，容易因泄露等原因出现需要特别精密的控制设计，容易因泄露等原因出现不重复进样。正、负压进样都需要密封技术。压力不重复进样。正、负压进样都需要密封技术。压力进样没有进样歧视现象，但选择性差，样品及其背进样没有进样歧视现象，但选择性差，样品及其背景都同时被引进管中，对后续分离可能产生影响。景都同时被引进管中，对后续分离可能产

30、生影响。二、分离系统二、分离系统 在毛细管电泳中，参与电泳分离的硬件系统主要在毛细管电泳中，参与电泳分离的硬件系统主要包括毛细管、毛细管恒温系统、直流高压电源、电包括毛细管、毛细管恒温系统、直流高压电源、电极和缓冲液池。极和缓冲液池。(1)毛细管：电泳分离过程的核心部件是毛细管电泳毛细管：电泳分离过程的核心部件是毛细管电泳柱。毛细管内径非常小，外保护层很厚，便于弯曲柱。毛细管内径非常小，外保护层很厚，便于弯曲使用使用,如图如图4.7所示。理想的毛细管材料应该具备化学所示。理想的毛细管材料应该具备化学和电惰性、紫外可见光透光性、柔韧性、强度高、和电惰性、紫外可见光透光性、柔韧性、强度高、耐用而且

31、便宜等特性。耐用而且便宜等特性。图图4.7 毛细管及毛细管内离子化示意图毛细管及毛细管内离子化示意图目前毛细管柱材料有熔融石英、聚四氟乙烯和玻璃目前毛细管柱材料有熔融石英、聚四氟乙烯和玻璃等，其中最常用的为熔融石英。石英毛细管外壁涂等，其中最常用的为熔融石英。石英毛细管外壁涂一层聚酸亚胺保护层，以增强弹性，便于操作。但一层聚酸亚胺保护层，以增强弹性，便于操作。但为了柱上光学检测，需要将毛细管外壁中一段聚酸为了柱上光学检测，需要将毛细管外壁中一段聚酸亚胺保护层除去以形成一个小检测窗口。聚四氟乙亚胺保护层除去以形成一个小检测窗口。聚四氟乙烯材料可以透过紫外光，不需要特殊的光学检测窗。烯材料可以透过

32、紫外光，不需要特殊的光学检测窗。常用的毛细管有效长度为常用的毛细管有效长度为3075cm，所使用的毛，所使用的毛细管内径一般在细管内径一般在25100m范围内。范围内。(2)毛细管恒温系统：有高速气流恒温和液体浴恒毛细管恒温系统：有高速气流恒温和液体浴恒温两种方式。温两种方式。(3)直流高压电源：直流高压电源：常用的高压电源为常用的高压电源为030 kV，操作电压稳定在操作电压稳定在0.1%，电流，电流200300A。(4)电极和缓冲液池：电极和缓冲液池：电极应选择化学惰性、导电电极应选择化学惰性、导电性能好的铂电极；缓冲液池一般用小玻璃瓶或聚性能好的铂电极；缓冲液池一般用小玻璃瓶或聚四氟乙烯

33、离心管；缓冲液要经常更换。四氟乙烯离心管；缓冲液要经常更换。三、检测系统三、检测系统 迄今为止迄今为止,除了原子吸收光谱、电感耦合等离除了原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱子体发射光谱(ICP)及红外光谱未用于及红外光谱未用于CE外外,其其它检测手段如：紫外、荧光、电化学、质谱、激它检测手段如：紫外、荧光、电化学、质谱、激光等类型检测器均已用于光等类型检测器均已用于CE。但常用的是紫外。但常用的是紫外-可见光检测、二极管阵列检测。可见光检测、二极管阵列检测。已有多种灵敏度很高的检测器为毛细管电泳提已有多种灵敏度很高的检测器为毛细管电泳提供质量保证，如紫外检测器供质量保证，如紫外检测器(UV

34、)、激光诱导荧、激光诱导荧光检测器光检测器(LIF)、能提供三维图谱的二极管阵列、能提供三维图谱的二极管阵列检测器检测器(DAD)以及电化学检测器以及电化学检测器(ECD)。由于毛。由于毛细管的管径细小、散热快，即使是高的电场和细管的管径细小、散热快，即使是高的电场和温度，都不会像常规凝胶电泳那样使胶变性，温度，都不会像常规凝胶电泳那样使胶变性，影响分辨率。影响分辨率。(1)光学检测器：按检测方式可分为固定波长或可光学检测器：按检测方式可分为固定波长或可变波长检测器和二极管阵列或波长扫描检测器两变波长检测器和二极管阵列或波长扫描检测器两类。前一类检测器采用滤光片或光栅来选取所需类。前一类检测器

35、采用滤光片或光栅来选取所需检测波长，优点在于结构简单，灵敏度比后一类检测波长，优点在于结构简单，灵敏度比后一类检测器高，后一类检测器能提供时间检测器高，后一类检测器能提供时间-波长波长-吸光吸光度的三维图谱，优点在于在线紫外光谱可用来定度的三维图谱，优点在于在线紫外光谱可用来定性、鉴别未知物。有些二极管阵列检测器还可做性、鉴别未知物。有些二极管阵列检测器还可做到在线峰纯度检查，即在分离过程中便可得知每到在线峰纯度检查，即在分离过程中便可得知每个峰含有几种物质，缺点在于灵敏度比前一类略个峰含有几种物质，缺点在于灵敏度比前一类略差。差。为了提高检测灵敏度，一种新的激光诱导共振为了提高检测灵敏度，一

36、种新的激光诱导共振能转移能转移(Laser Induced Resonance Energy Transfer)检测方法已经诞生，例如检测方法已经诞生，例如EDTA和镧系和镧系化合物特别是化合物特别是Tb3+(在水杨酸存在下在水杨酸存在下)形成三元络形成三元络合物，此络合物于合物，此络合物于pH 3的条件下稳定而有荧光，的条件下稳定而有荧光，能量从水杨酸向能量从水杨酸向Tb3+转移，这一过程可提高检转移，这一过程可提高检测的灵敏度。测的灵敏度。由于由于CE检测池的光路长度即为毛细管的内径，检测池的光路长度即为毛细管的内径，一般不超过一般不超过100 m，因此，细内径的毛细管，因此，细内径的毛细

37、管柱限制了紫外检测器的灵敏度。欲提高检测柱限制了紫外检测器的灵敏度。欲提高检测灵敏度，可采用以下几种方法灵敏度，可采用以下几种方法:优化测定波优化测定波长；的信噪比来选择最佳测定波长，以提高长；的信噪比来选择最佳测定波长，以提高灵敏度。减少检测噪音灵敏度。减少检测噪音:主要通过提高光源主要通过提高光源强度；采用聚焦、狭缝等减少背景光的影响；强度；采用聚焦、狭缝等减少背景光的影响；采用电子和数字滤波，设计良好的信号放大采用电子和数字滤波，设计良好的信号放大系统。系统。除了常用的氘灯和原子蒸气灯除了常用的氘灯和原子蒸气灯(汞、锌、镉灯汞、锌、镉灯)外，还有一种外，还有一种“笔式线光源镉灯笔式线光源

38、镉灯”(pen-ray lamp)，可将光线聚焦到毛细管上。扩展吸，可将光线聚焦到毛细管上。扩展吸光光路长度光光路长度:可通过很多巧妙的设计来扩展光路可通过很多巧妙的设计来扩展光路长度，如长度，如:为了克服圆柱形毛细管表面引起散射、为了克服圆柱形毛细管表面引起散射、失真等不利的光学特性及增加光路长度，可用失真等不利的光学特性及增加光路长度，可用矩形或扁形毛细管，如用矩形或扁形毛细管，如用50 X 1000 m截面的截面的矩形管，光路长度扩大矩形管，光路长度扩大20倍，可使信噪比增加倍，可使信噪比增加15倍，当然柱效也会有所下降。倍，当然柱效也会有所下降。也有采用也有采用“泡型泡型”或或“Z型型

39、”特殊毛细管的，如特殊毛细管的，如泡型毛细管可使光径从泡型毛细管可使光径从50 m增至增至500 m;Z型可型可使光径从使光径从50 m增至增至3 mm，增加了近，增加了近60倍，可使倍，可使信噪比提高至原来的信噪比提高至原来的6倍，但因体积增加将引起倍，但因体积增加将引起20%30%的谱带扩张，导致柱效下降。的谱带扩张，导致柱效下降。(2)荧光检测器：普通荧光检测器荧光检测器：普通荧光检测器:采用氘灯采用氘灯(低低波长波长UV区区)、氙弧灯、氙弧灯(UV到可见光区到可见光区)和钨灯和钨灯(可可见光区见光区)作为激发光源，对荧光黄检测限可达作为激发光源，对荧光黄检测限可达2 ng mL-1。另

40、一种为激光诱导荧光检测器。另一种为激光诱导荧光检测器(LIF,图图4.8):激光的高光流量、聚光性、单色性等特激光的高光流量、聚光性、单色性等特点使其成为理想的激发源。常用氦一镉激光器点使其成为理想的激发源。常用氦一镉激光器(325 nm)和氩离子激光器和氩离子激光器(488 nm)。对荧光黄。对荧光黄最低检测限为最低检测限为10-11 mol L-1。LIF检测器主要检测器主要由激光器、光路系统、检测池和光电转换器件由激光器、光路系统、检测池和光电转换器件等部分组成。按入射激光、毛细管和荧光采集等部分组成。按入射激光、毛细管和荧光采集方向的对应位置，方向的对应位置，CE的的LIF系统可分为正

41、交型系统可分为正交型和共线型两种。和共线型两种。图图4.8 LIF检测器结构检测器结构正交结构中荧光采集透镜垂于毛细管和入射激光正交结构中荧光采集透镜垂于毛细管和入射激光所构成的平面。共线结构中光源、聚焦光和荧光所构成的平面。共线结构中光源、聚焦光和荧光共面，且入射光和发射荧光采用同一透镜聚焦。共面，且入射光和发射荧光采用同一透镜聚焦。近年在毛细管电泳中出现一些新的荧光检测器，近年在毛细管电泳中出现一些新的荧光检测器，如有人提出在如有人提出在near-Geiger操作下的雪崩光电二极操作下的雪崩光电二极管用作毛细管电泳荧光检测器；基于激光波混合管用作毛细管电泳荧光检测器；基于激光波混合的方法以

42、提高毛细管电泳的灵敏度；为提高灵敏的方法以提高毛细管电泳的灵敏度；为提高灵敏度使用双光子激发荧光检测器等。度使用双光子激发荧光检测器等。(3)化学发光检测器：把化学发光检测器：把HPLC化学发光检测器也化学发光检测器也用于毛细管电泳。用于毛细管电泳。(4)电荷耦合检测器：近年来在毛细管电泳中用电电荷耦合检测器：近年来在毛细管电泳中用电荷耦合检测器荷耦合检测器(Charge-Coupled Device，CCD)受到人们的重视。有些学者把受到人们的重视。有些学者把CCD用于矩形薄用于矩形薄层槽电泳的检测上。层槽电泳的检测上。(5)电化学检测器：电化学检测器电化学检测器：电化学检测器(EC)可避免

43、可避免CE中中光学类检测器遇到的光程太短的间题。光学类检测器遇到的光程太短的间题。EC和和LIF同为同为CE中灵敏度最高的检测器，电化中灵敏度最高的检测器，电化学检测器的研究已有不少，有安培型电化学检测学检测器的研究已有不少，有安培型电化学检测器器(在固定电压下测定电流的大小在固定电压下测定电流的大小)和伏安型电化和伏安型电化学检测器学检测器(在不同的电压下测定电流在不同的电压下测定电流)，前者使用，前者使用较多，因为仪器简单、检测限也很低，但是安培较多，因为仪器简单、检测限也很低，但是安培法只能提供一个电流随时间变化的信息，而伏安法只能提供一个电流随时间变化的信息，而伏安法还可以得到电流随电

44、压变化的信息，这样有助法还可以得到电流随电压变化的信息，这样有助于在混合物中鉴定个别化合物，对分离不好的化于在混合物中鉴定个别化合物，对分离不好的化合物提供一个用电化学方法解决问题的机会。合物提供一个用电化学方法解决问题的机会。在安培法检测中近年的研究有一些新的改进，如在安培法检测中近年的研究有一些新的改进，如改进的柱尾安培法检测；用刻蚀毛细管壁形成半改进的柱尾安培法检测；用刻蚀毛细管壁形成半透膜作连接器的安培检测器；毛细管电泳中用盘透膜作连接器的安培检测器；毛细管电泳中用盘状工作电极进行柱尾安培检测的电流理论的研究；状工作电极进行柱尾安培检测的电流理论的研究；用于微米和亚微米连续槽电泳分离的

45、阵列电化学用于微米和亚微米连续槽电泳分离的阵列电化学检测器。检测器。(6)质谱检测器：质谱检测器：CE和能提供组分结构信息的质谱和能提供组分结构信息的质谱(MS)联用，是分析技术的跨越式进步。联用，是分析技术的跨越式进步。目前已有商品目前已有商品CE/MS系统，提供了一种分离和系统，提供了一种分离和鉴定相结合的强有力的技术。鉴定相结合的强有力的技术。CE/MS在线联用，在线联用，接口系统是其接口系统是其“心脏心脏”，既要保持，既要保持CE的高效性，的高效性，又要满足又要满足MS仪器的要求，通常需考虑样品离子仪器的要求，通常需考虑样品离子化技术和化技术和CE/MS接口的设计。虽然有多种离子接口的

46、设计。虽然有多种离子化技术可用于化技术可用于MS，但用于，但用于CE/MS的仅有快原子的仅有快原子轰击轰击(FAB)和大气压离子化和大气压离子化(API，其中又可分为，其中又可分为电喷雾电喷雾ESI和离子喷雾和离子喷雾ISP)两种。接口设计有同两种。接口设计有同轴接口和液体连接接口。轴接口和液体连接接口。4.5.3 毛细管电泳分离的优化毛细管电泳分离的优化一、毛细管电泳的操作电压一、毛细管电泳的操作电压 最佳操作电压的选择：在不产生过多焦耳热的前最佳操作电压的选择：在不产生过多焦耳热的前提条件下，尽可能使用高电压。分离柱效随电压提条件下，尽可能使用高电压。分离柱效随电压的增大而提高。的增大而提

47、高。电源工作模式的选择：恒压、恒流、恒功率和场电源工作模式的选择：恒压、恒流、恒功率和场强程序。强程序。二、毛细管电泳的缓冲溶液二、毛细管电泳的缓冲溶液 缓冲溶液的选择对于毛细管电泳的成功分离缓冲溶液的选择对于毛细管电泳的成功分离十分重要。电渗流对于十分重要。电渗流对于pH的改变非常敏感，所的改变非常敏感，所以要求使用缓冲溶液以维持恒定的以要求使用缓冲溶液以维持恒定的pH。缓冲液。缓冲液的有效缓冲范围是的有效缓冲范围是pH在在pKa1的区间内，在毛的区间内，在毛细管电泳中使用的缓冲溶液应该从以下几个方细管电泳中使用的缓冲溶液应该从以下几个方面优化：面优化：(1)在所选的在所选的pH范围内应有较

48、强的缓冲能力。优化范围内应有较强的缓冲能力。优化原则：为了得到合适的电泳淌度，缓冲液的原则：为了得到合适的电泳淌度，缓冲液的pH必须比被分离物质的等电点高或低必须比被分离物质的等电点高或低1个个pH单位。单位。为了使毛细管壁上的吸附和电渗流降低，提高为了使毛细管壁上的吸附和电渗流降低，提高毛细管涂层的寿命，尽可能采用酸性缓冲液。毛细管涂层的寿命，尽可能采用酸性缓冲液。注意注意pH不同会改变液体流动方向，如蛋白质的等不同会改变液体流动方向，如蛋白质的等电点低于缓冲液电点低于缓冲液pH时，极性放置是：正极时，极性放置是：正极 负负极，反之应是：负极极，反之应是：负极正极。正极。(2)避免缓冲液在检

49、测波长处有低的紫外吸收，造成避免缓冲液在检测波长处有低的紫外吸收，造成背景干扰过强。背景干扰过强。(3)尽量保持较低的淌度（即分子量大、电荷小的离尽量保持较低的淌度（即分子量大、电荷小的离子）以降低所产生的电流。使用较多的缓冲液是：子）以降低所产生的电流。使用较多的缓冲液是：磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液。一般情磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液。一般情况下，缓冲液浓度增加被分离物质的迁移速度下况下，缓冲液浓度增加被分离物质的迁移速度下降降(图图4.9)，有利于分离效果的提高，但随着缓冲，有利于分离效果的提高，但随着缓冲液浓度的增大，粘度增加，电渗流和焦耳热增大，液浓度的增大，粘度增加，电

50、渗流和焦耳热增大，给分离造成反作用。给分离造成反作用。在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，如表细管中的电流有较大差别，如表4.12，因此产生，因此产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。表表4.12 不同阴离子构成的缓冲液对电渗淌度的影响不同阴离子构成的缓冲液对电渗淌度的影响 阴离子阴离子B3O72-Cit3-Ac