第六章微生物遗传变异课件.pptx

1、第六章微生物遗传变异几个基本概念 变异变异(variation):指生物体在某种外指生物体在某种外因或内因作用下引因或内因作用下引起的遗传物质结构起的遗传物质结构或数量的改变，亦或数量的改变，亦即遗传型的改变。即遗传型的改变。饰变饰变(modification):指不涉及遗传物质指不涉及遗传物质结构改变而只发生结构改变而只发生在转录、转译水平在转录、转译水平上的表型变化。上的表型变化。遗传遗传(heredity或或inheritance)和变异和变异(variation)是生物体最是生物体最本质的属性之一。本质的属性之一。在遗传性适宜的环境条件下时，在遗传性适宜的环境条件下时，通过代谢和发育才

2、能使其后代转通过代谢和发育才能使其后代转化为与亲代相同的具体性状。化为与亲代相同的具体性状。本章主要内容 一、证明核酸是遗传变异物质基础的经一、证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验典实验 肺炎双球菌的转化实验肺炎双球菌的转化实验 噬菌体的感染实验噬菌体的感染实验 烟草花叶病毒的拆开与重组实验烟草花叶病毒的拆开与重组实验 先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶(如细菌可用溶菌酶或青霉素处理，放线菌可用溶菌酶或相应的脱壁酶，真菌可用蜗牛酶或相应的脱壁酶等)去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂PEG(聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生

3、细胞壁 或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子四种碱基的第六位上不是酮基（T和G）就是氨基（A和C）定向培育是人为利用一特定环境条件长期处理某一微生物群体，同时不断将它们进行移种传代，以达到累积和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。（一）细胞水平在菌种的性状没有发生退化之前，定期进行纯种分离和性能检测。真核微生物的细胞核有核膜包围，形成具有完整形态、在光学显微镜下清晰可见的细胞核，核内DNA 与组蛋白结合在一起构成染色体。结果发现，几乎全部 35S 都在上清液中，而几乎全部 32P 和细菌一起出现在沉淀物中。Col因子（

4、colicinogenic factor）：即产大肠杆菌素因子。这是一种与转导相似但又有本质不同的现象。在细菌中，接合现象研究最清楚的是大肠杆菌。稀释平板法、平板划线法等F因子又称致育因子，是一种质粒，分子量为 5107 道尔顿。这些实验说明：加热杀死的S型细菌，在其细胞内可能存在一种转化物质，这种转化物质能通过某种方式进入R型细胞，并使得R型细胞获得稳定的遗传性状。以上结果表明 只有S型菌株的DNA才能将S.pmeumoniae 的R型转化成S型。DNA纯度越高，转化效率也越高。转移的是以DNA为物质基础的遗传因子，而不是遗传性状本身（荚膜多糖）。（二）（二）噬菌体的感染实验噬菌体的感染实验

5、 1952 1952 年，侯喜年，侯喜(A.Hershey)A.Hershey)和蔡斯和蔡斯(M.Chase)M.Chase)发表了证发表了证明明DNADNA是噬菌体的遗传物质的实验：是噬菌体的遗传物质的实验：先用含有放射性先用含有放射性3535SOSO4 42-2-或或 3232POPO4 43-3-的培养基培养大肠杆的培养基培养大肠杆菌，然后让菌，然后让 T2 T2 噬菌体侵染培养后的大肠杆菌，从而使噬菌体侵染培养后的大肠杆菌，从而使 T2 T2 噬菌体打上噬菌体打上 3535S S 或或 3232P P 的标记。的标记。让这种让这种 T2 T2 噬菌体侵染不含标记元素的大肠杆菌噬菌体侵染

6、不含标记元素的大肠杆菌 吸附和侵入后，吸附和侵入后，强烈搅拌洗涤，再进行离心沉淀，分别强烈搅拌洗涤，再进行离心沉淀，分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。测定沉淀物和上清液中的同位素标记。结果发现，几乎全部结果发现，几乎全部 3535S S 都在上清液中，而几乎全部都在上清液中，而几乎全部 3232P P 和细菌一起出现在沉淀物中。和细菌一起出现在沉淀物中。The Hershey-Chase experiment（三）（三）烟草花叶病毒的拆开与重组实验烟草花叶病毒的拆开与重组实验 1956年，美国的法朗克-康勒特(Fraenkel-Conrat)将烟草花叶病毒拆成RNA和蛋白质，并分别对烟草进

7、行感染实验；结果发现只有RNA能感染烟草，并在感染后的寄主中分离到完整的具蛋白质外壳的烟草花叶病毒。后来他又将甲、乙两种变种的烟草花叶病毒拆开，在体外分别将甲病毒的 RNA和乙病毒的蛋白质结合，将乙病毒的RNA 和甲病毒的蛋白质结合进行重组。接着他把这些经过重组的病毒分别感染烟草。结果从寄主分离所得的病毒蛋白质均取决于相应病毒的 RNA。证明了核酸(RNA)是烟草花叶病毒的遗传物质基础。（三）烟草花叶病毒的拆开与重组实（三）烟草花叶病毒的拆开与重组实验验 霍氏车前花叶霍氏车前花叶病毒病毒拆开的病毒拆开的病毒杂合的病毒杂合的病毒罹病的烟叶罹病的烟叶重新分离的病毒重新分离的病毒TMV重建实验示意图

8、重建实验示意图TMVHRV烟草花叶病毒感染分离纯化重建原始病毒 二、DNA的结构与复制（一）（一）DNA的结构：的结构：DNA单体：核苷酸单体：核苷酸磷酸磷酸+核糖核糖+碱基碱基 A（腺嘌呤）（腺嘌呤）T（胸腺嘧啶）（胸腺嘧啶）C（胞嘧啶）（胞嘧啶）G（鸟嘌呤）（鸟嘌呤）两条核苷酸链两条核苷酸链 多聚核苷酸多聚核苷酸 碱基在内碱基在内两链上碱基互补配对两链上碱基互补配对（氢键相连）（氢键相连）AT GC 脱氧核糖、磷酸向外脱氧核糖、磷酸向外 Three representations of DNA.（一）细胞水平（一）细胞水平细胞核细胞核；在细胞质中存在着一些能自我复制的遗传物质，一般称在细胞

9、质中存在着一些能自我复制的遗传物质，一般称这部分这部分DNA DNA 为为质粒质粒。（二）细胞核水平（二）细胞核水平 真核微生物的细胞核有核膜包围，形成具有完整真核微生物的细胞核有核膜包围，形成具有完整形态、在光学显微镜下清晰可见的细胞核，核内形态、在光学显微镜下清晰可见的细胞核，核内DNA DNA 与组蛋白结合在一起构成染色体。与组蛋白结合在一起构成染色体。原核生物的原核生物的DNADNA与很少量蛋白质结合，没有核膜包与很少量蛋白质结合，没有核膜包围，由围，由DNADNA细丝构成环状染色体。细丝构成环状染色体。（三）分子水平（三）分子水平 DNADNA（RNA RNA）在在DNA DNA 大

10、分子上存在着决定某些遗大分子上存在着决定某些遗传性状的特定区段，即所谓基因传性状的特定区段，即所谓基因一个基因含若一个基因含若干核苷酸碱基组成的三联密码。干核苷酸碱基组成的三联密码。四种核苷酸，按其排列组合方式的不同，可编出三联四种核苷酸，按其排列组合方式的不同，可编出三联密码密码 4 43 36464个，用于决定组成蛋白质的个，用于决定组成蛋白质的20 20 种氨基酸种氨基酸顺序。起始密码（顺序。起始密码（AUGAUG）和终止密码（和终止密码（UAAUAA、UGAUGA和和UAGUAG）。）。2、基因、基因 在生物体内，一切具有自主复制能力的遗传功能单位，都可称为基因。其物质基础是一个具有特

11、定核苷酸顺序的核酸片断，每个基因一般含有1000bp(碱基对)。基因调基因调控系统控系统操纵子操纵子调节基因调节基因启动基因启动基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因酶及结酶及结构蛋白构蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白原核生物的基因通过组成以下的调控原核生物的基因通过组成以下的调控系统而发挥作用：系统而发挥作用：大肠杆菌乳糖操纵子大肠杆菌乳糖操纵子莫诺与雅可布因提出“操纵子学说”而荣获1965年诺贝尔生理学与医学奖。1969年，贝克维斯（JRBeckwith）从大肠杆菌的DNA中分离出乳糖操纵子，完全证实了雅可布和莫诺的模型。乳糖操纵子关闭原核生物的质粒原核生物的质粒 游离于原核生物染色体外，具有独立复游离

12、于原核生物染色体外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状制能力的小型共价闭合环状DNA分子，分子，称为质粒，即称为质粒，即 cccDNA (circular covalently closed DNA)。几种细菌的质粒几种细菌的质粒 F因子因子（fertility factor）：又称致育）：又称致育因子或性因子。是因子或性因子。是E.Coli等细菌中决定等细菌中决定性别的质粒。性别的质粒。R因子因子（resistance factor）:又称又称R质粒，即抗抗生素或化学治疗剂因子。质粒，即抗抗生素或化学治疗剂因子。R因子对多种抗生素有抗性，可作筛选时因子对多种抗生素有抗性，可作筛选时的理想标记

13、，也可用作基因载体。的理想标记，也可用作基因载体。Col因子因子（colicinogenic factor）：）：即产大肠杆菌素因子。许多细菌都能产即产大肠杆菌素因子。许多细菌都能产生使其他原核生物致死的蛋白质类细菌生使其他原核生物致死的蛋白质类细菌毒素。大肠杆菌素（毒素。大肠杆菌素（colicin）具有通过）具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其他肠道细菌的功能。专一地杀死其他肠道细菌的功能。Ti质粒质粒(tumor inducing plasmid)：即诱癌质粒。即诱癌质粒。巨大质粒巨大质粒(mega plasmid)：在根瘤菌：在根瘤菌属

14、中发现的一种质粒，其上有一系列固属中发现的一种质粒，其上有一系列固氮基因。氮基因。降解性质粒降解性质粒:只在假单胞菌属中发现。只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质作碳源。所难以分解的物质作碳源。3、遗传信息的传递 中心法则4.DNA的复制三、DNA的变性和复性 当天然双链当天然双链DNA受热受热或在或在其他因素其他因素的作用下的作用下，两条链之间的结合力被破坏而分开成单链，两条链之间的结合力被破坏而分开成单链DNA，称为，称为DNA变性。变性。其他因素：其他

15、因素：pH，达，达11.3时，氢键完全消失时，氢键完全消失尿素尿素硫胺硫胺三、DNA的变性和复性 退火：退火：变性变性DNA溶液经适当处理后重新形成溶液经适当处理后重新形成天然天然DNA的过程叫退火。的过程叫退火。四、RNA 碱基四种：碱基四种：RNA有四种：有四种：RNARNA RNA反义反义RNA，是在，是在 RNA转录的同时形成的短的片转录的同时形成的短的片段，起调节作用，决定段，起调节作用，决定 RNA翻译合成速率。翻译合成速率。年美国科学家研究质粒的复制时发现了反义RNA。五、遗传密码六、蛋白质的合成 蛋白质合成过程：蛋白质合成过程：转录转录翻译翻译多肽链形成多肽链形成 突变率突变率

16、（mutation ratemutation rate）：）：每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率，称突变率。率，称突变率。突变率为突变率为1010-8-8的，即指该细胞在一亿次细胞分裂中，的，即指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。会发生一次突变。或者一个含有或者一个含有10108 8个细胞的群体，当其分裂为个细胞的群体，当其分裂为2 210108 8个个细胞时，即可平均发生一次突变的突变几率也是细胞时，即可平均发生一次突变的突变几率也是1010-8-8。基因突变简称突变，是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构突然发生可遗传的变化。

17、紫外辐射诱变机制紫外辐射诱变机制 DNA强烈吸收紫外辐射后引起强烈吸收紫外辐射后引起DNA结构变化结构变化，其变化形式有：，其变化形式有：DNA链的断裂链的断裂DNA分子内和分子间的交联，分子内和分子间的交联，核酸与蛋白质的交联核酸与蛋白质的交联胞嘧啶和鸟嘌呤的水合作用胞嘧啶和鸟嘌呤的水合作用胸腺嘧啶二聚体的形成胸腺嘧啶二聚体的形成微生物能以多种方式去修复被紫外线微生物能以多种方式去修复被紫外线损伤后的损伤后的 DNA，主要方式有两种：主要方式有两种：（1 1）光复活作用。）光复活作用。光复活：细菌中的光复活：细菌中的DNA光解酶光解酶(photolyase)完成完成 特异性识别紫外线造成的核

18、酸链上相邻嘧啶共价结合特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合；的二聚体，并与其结合；结合后如受结合后如受300600nm波长的光照射，则此酶就波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从酶从DNA链上释放，链上释放，DNA恢复正常结构。恢复正常结构。（2）暗修复作用。也称切除修复作用。暗修复作用。也称切除修复作用。T T胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶二聚体 切除修复有四种酶的参与：切除修复有四种酶的参与：内切酶内切酶外切酶外切酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶 DNA损伤修复的其他方式

19、损伤修复的其他方式 重组修复 修复 适应性修复定向培育和驯化 定向培育定向培育是人为利用一特定环境条件长是人为利用一特定环境条件长期处理某一微生物群体，同时不断将它期处理某一微生物群体，同时不断将它们进行移种传代，以达到累积和选择合们进行移种传代，以达到累积和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法适的自发突变体的一种古老的育种方法。环境工程中称驯化环境工程中称驯化 基因重组又称为遗传重组，它是指把两个不同基因重组又称为遗传重组，它是指把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的过程分子的重新组合后，形成新遗传型

20、个体的过程。真核微生物中的有性杂交，准性生殖真核微生物中的有性杂交，准性生殖以及以及原核原核微生物中的转化、转导、接合和溶原转变微生物中的转化、转导、接合和溶原转变等都等都是基因重组在细胞水平上的反映。是基因重组在细胞水平上的反映。受体菌直接吸收来自供体菌的受体菌直接吸收来自供体菌的DNA DNA 片段，通过交换组合把它整片段，通过交换组合把它整合到自己的基因组中，从而获得合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象了供体菌的部分遗传性状的现象，称为转化。，称为转化。只有处于只有处于感受态感受态的细菌才能接受的细菌才能接受转化因子，进行转化作用。转化因子，进行转化作用。受体细胞的感

21、受受体细胞的感受态态(competence)(competence)感受态因子是感受态因子是一种胞外蛋白一种胞外蛋白转化过程的几个阶段：双链DNA片段与感受态受体菌细胞表面特定位点结合 DNA被分解成片段 DNA双链中的一条单链被切除，另一条单链进入细胞 供体单链DNA片段与受体细胞核染色体组的同源区段配对，受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA交换、整合和取代，形成杂合区段 受体菌的染色体组进行复制 细胞分裂后形成转化子 1普遍性转导普遍性转导 由缺陷型噬菌体误包（而非整合）供体由缺陷型噬菌体误包（而非整合）供体细菌细菌DNA 中的任何一部分片段（包括核外遗传物质在内）中的

22、任何一部分片段（包括核外遗传物质在内）后，当它再次感染受体细菌时，使后者获得了这部分遗传后，当它再次感染受体细菌时，使后者获得了这部分遗传性状的现象，称为普遍性转导。它的转导频率为性状的现象，称为普遍性转导。它的转导频率为10-510-8。2局限性转导局限性转导 由温和噬菌体侵染而形成的某一溶源细由温和噬菌体侵染而形成的某一溶源细菌群被诱导裂解时，其中极少数个体的菌群被诱导裂解时，其中极少数个体的DNA 可能与噬菌可能与噬菌体体DNA 发生若干特定基因的交换，从而被整合到噬菌体发生若干特定基因的交换，从而被整合到噬菌体的基因组上，当该噬菌体再次感染受体细菌时，就使受体的基因组上，当该噬菌体再次

23、感染受体细菌时，就使受体细菌获得了这一特定遗传性状的现象，称为局限性转导，细菌获得了这一特定遗传性状的现象，称为局限性转导，它的转导频率为它的转导频率为10-4 10-6。通过供体细菌和受体细菌完整细胞间的直接接通过供体细菌和受体细菌完整细胞间的直接接触而传递大段触而传递大段DNA DNA 的过程，称为接合（有时也称的过程，称为接合（有时也称杂交）。杂交）。在细菌中，接合现象研究最清楚的是大肠杆菌。在细菌中，接合现象研究最清楚的是大肠杆菌。发现能够进行接合现象的大肠杆菌有发现能够进行接合现象的大肠杆菌有雄性雄性与与雌性雌性之分，而决定它们性别的是由是否存在之分，而决定它们性别的是由是否存在 F

24、 F 因子因子所决定。所决定。F F因子又称致育因子，是一种质粒，分子量为因子又称致育因子，是一种质粒，分子量为 5 510107 7 道尔顿。道尔顿。雌性细菌不含雌性细菌不含F 因子，称为因子，称为F-菌株，菌株，雄性细菌含有游离存在的雄性细菌含有游离存在的F 因子，称为因子，称为F+菌菌株，株，当雄性细菌细胞中所含的当雄性细菌细胞中所含的F 因子被整合在细胞因子被整合在细胞核的核的DNA 上，不呈游离状态存在称为上，不呈游离状态存在称为Hfr 菌菌株（高频重组菌株）；株（高频重组菌株）；有时被整合在细胞核有时被整合在细胞核DNA 上的上的F 因子，从因子，从DNADNA上面脱落下来，呈游离

25、存在，但在脱落时，上面脱落下来，呈游离存在，但在脱落时，F 因子有时能带一小段细胞核因子有时能带一小段细胞核 DNA。我们将这我们将这种含有游离存在的但又带有一小段细胞核种含有游离存在的但又带有一小段细胞核DNA 的的F 因子的细菌称为因子的细菌称为 F菌株。菌株。是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。（四）原生质体融合（四）原生质体融合 通过人为方法，使遗传性状不同的两细通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，称为原生质体融合或细胞融合的过程，称为原生质体融合或细胞融合。先准备两

26、个有选择性遗传标记的突变株，在高渗先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶溶液中，用适当的脱壁酶(如细菌可用溶菌酶或如细菌可用溶菌酶或青霉素处理，放线菌可用溶菌酶或相应的脱壁酶青霉素处理，放线菌可用溶菌酶或相应的脱壁酶，真菌可用蜗牛酶或相应的脱壁酶等，真菌可用蜗牛酶或相应的脱壁酶等)去除细胞去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂合剂PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁中稀释，涂在能使其再生细胞壁 或进行分裂的或进行分裂的培养基上，待形成菌落

27、后，通过影印接种法，将培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子否是重组子 形成菌落（五）溶源性转变（五）溶源性转变 一、菌种的退化与复壮 变异是随机的：正变、负变 菌种退化是指群体中退化细胞占一定数量后表现出的菌种性能下降。为了使微生物的优良性状持久延续下去，必须做好复壮工作：在菌种的性状没有发生退化之前，定期进行纯种分离和性能检测。菌种复壮的方法：（一）纯种分离稀释平板法、平板划线法等显微操作将生长良好的单细胞或单孢子分离出来（二）通过寄主进行复壮适用于寄生性微生物，接种到相应寄主体内可以提高菌株

28、对宿主的感染力。（三）淘汰已衰退个体如用低温处理 streptomyces microflows“5406”抗生菌的分生孢子采用-10-30低温处理5-7天，使其死亡率达到80%，保留存活个体达到复壮目的。二、菌种的保藏 首先要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用它们的休眠体（分生孢子、芽孢等）；创造一个适合长期休眠的环境条件：干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养剂添加保护剂或酸度中和剂等。我国一般采用三种保藏法：固体培养基斜面上定期移植法（5以下保藏）石蜡油封藏法（室温下）冷冻干燥保藏法（10以下保藏）放线菌：砂土保藏法 丝状真菌：麸皮保藏法两种最有效方法：冷冻干燥法：保藏期达515年液氮保藏法：2

29、0年以上 在基因水平上的遗传工程，它用人为的方在基因水平上的遗传工程，它用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质法将所需的某一供体生物的遗传物质-DNADNA大分子提取出来，在离体的条件下用大分子提取出来，在离体的条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的体的DNADNA分子连接起来，然后与载体一起分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中进行正常的复制以让外源遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。种技

30、术。目的基因（即外源基因或供体基因）的目的基因（即外源基因或供体基因）的取得取得 载体系统的选择载体系统的选择 目的基因与载体重组体的构建目的基因与载体重组体的构建 重组载体导入受体细胞重组载体导入受体细胞 工程菌或工程细胞株的表达、检测以及工程菌或工程细胞株的表达、检测以及实验室和一系列生产性试验等实验室和一系列生产性试验等基因工程菌株的构建基因工程菌株的构建 1 1提取目的基因提取目的基因 用密度梯度离心方用密度梯度离心方法分别从供体细胞中提取所需要的法分别从供体细胞中提取所需要的DNADNA即即目的基因和作为载体的细菌质粒或噬菌目的基因和作为载体的细菌质粒或噬菌体核酸，目的基因也可通过化

31、学方法人体核酸，目的基因也可通过化学方法人工合成。工合成。2 2处理目的基因处理目的基因 根据基因工程的根据基因工程的“设计蓝设计蓝图图”的要求，在从供体细胞中提取出的目的基的要求，在从供体细胞中提取出的目的基因中加入专一性很强的限制性核酸内切酶进行因中加入专一性很强的限制性核酸内切酶进行处理，从而获得带有特定基因并暴露出粘性末处理，从而获得带有特定基因并暴露出粘性末端的端的DNADNA单链部分。必要时这种粘性末端也可单链部分。必要时这种粘性末端也可用人工方法合成。用人工方法合成。对作为载体的细菌质粒或噬菌体对作为载体的细菌质粒或噬菌体DNADNA可采用与可采用与处理目的基因同一种类的限制性核

32、酸内切酶进处理目的基因同一种类的限制性核酸内切酶进行处理，使其形成并暴露出与目的基因相应的行处理，使其形成并暴露出与目的基因相应的粘性末端。粘性末端。3 3体外重组体外重组 将上述分别处理过的目的基因将上述分别处理过的目的基因和细菌质粒和细菌质粒DNADNA片段（或噬菌体核酸）放在试片段（或噬菌体核酸）放在试管中，在较低温度（管中，在较低温度（5 566）下混合）下混合“退火退火”。由于这两种。由于这两种DNADNA是用同一种限制性核酸内切是用同一种限制性核酸内切酶进行处理，具有相同的粘性末端，因此相互酶进行处理，具有相同的粘性末端，因此相互之间能够形成氢键，这就是所谓之间能够形成氢键，这就是

33、所谓“退火退火”。而。而相邻的核苷酸，在相邻的核苷酸，在DNADNA连接酶的作用下也能形连接酶的作用下也能形成磷酸二酯键，这样就完成了目的基因与质粒成磷酸二酯键，这样就完成了目的基因与质粒DNADNA（或噬菌体或噬菌体DNADNA）的重组，得到的是一个完的重组，得到的是一个完整的具有复制能力的环状整的具有复制能力的环状DNADNA重组体，即重组体，即“杂杂种质粒种质粒”（或杂种噬菌体）。（或杂种噬菌体）。4载体传递 即通过载体将供体生物中的遗传基因导入到受体细胞内。载体必须具有自我复制的能力，一般可利用质粒的转化作用或噬菌体的转导作用，将供体基因带入受体细胞内。对原核受体细胞来说，载体主要有两

34、种：细菌质粒和噬菌体对真核细胞来说载体主要有SV40病毒对植物来说载体主要是Ti质粒 5复制、表达 在理想情况下，进入受体细胞内的杂种质粒（或杂种噬菌体），可通过自我复制到扩增，并使受体细胞表达出作为供体细胞所固有的部分遗传性状，成为“工程菌”。广泛应用的受体细胞：E.Coli 枯草芽孢杆菌和酿酒酵母 6筛选、繁殖 当前，由于分离纯净的基因功能单位还很困难，所以通过重组后的“杂种质粒”的性状是否都符合原定的“设计蓝图”，以及它能否在受体细胞内正常增殖和表达等，都还需要经过仔细检查，以便能在大量个体中设法筛选出所需要性状的个体，然后才可加以繁殖和利用。2、平末端的连接：可先生成粘性末端，在带平头

35、末端的DNA片段的3-末端加上多聚核苷酸的尾巴，在载体上加上互补的尾巴，然后用DNA连接酶连接。生产多肽类药物、疫苗中的应用生产多肽类药物、疫苗中的应用改造传统工业发酵菌种改造传统工业发酵菌种动、植物特性的基因工程改良动、植物特性的基因工程改良基因工程在环境保护中的应用基因工程在环境保护中的应用(1)质粒育种多功能超级菌的构建多功能超级菌的构建 日本京都大学农学研究科应用微生物学教授村田幸作领导的研究小组成功利用转基因技术培养出一种超级细菌：将鞘氨醇单胞菌属的一种细菌的5个遗传基因提取后，植入另外一种分解二恶英细菌的基因内制造了这种超级细菌，其对高浓度二恶英具有耐药性，在被污染的现场生存能力强

36、，可持续分解。多功能超级菌的构建多功能超级菌的构建 目前研究小组正在研究利用转基因技术改造其它种类的细菌，用以净化重金属等有害物质或高效率制造有用物质。这一研究成果已刊载于2006年出版的自然生物技术上 19721972年美国的查可巴瑞开创了一项研究：直接年美国的查可巴瑞开创了一项研究：直接将不同来源的降解性质粒组建到一个受体菌细将不同来源的降解性质粒组建到一个受体菌细胞内，能获得胞内，能获得降解多种污染物的超级菌降解多种污染物的超级菌。19751975年他成功地在培养基上将年他成功地在培养基上将4 4种降解性质粒种降解性质粒转到转到1 1株细菌的细胞内，构建成举世瞩目的第株细菌的细胞内，构建

37、成举世瞩目的第一个一个“超级菌超级菌”。该种超级菌能同时。该种超级菌能同时降解降解7 7种种以上的石油烃类化合物以上的石油烃类化合物，几小时内的效果相当，几小时内的效果相当于自然菌株一年以上的同等水平。于自然菌株一年以上的同等水平。19821982年他又实现了细胞间质粒的自然传递和相年他又实现了细胞间质粒的自然传递和相互作用，构建出新的超级菌，新超级菌互作用，构建出新的超级菌，新超级菌清除石清除石油污染油污染所需时间不到传统方法的所需时间不到传统方法的1010，消耗费，消耗费用仅为传统方法的用仅为传统方法的3535。原核微生物之间的基因工程原核微生物之间的基因工程 多功能超级菌可提高废水处理能

38、力同时降解氯化芳烃和甲基芳烃的大肠杆菌三氯苯甲酸酯的降解菌 除草剂（2,4-D）的高效降解菌，修复土壤污染 难降解人工合成物质的生物降解（尼龙）抗汞、抗镉、抗铅的大肠杆菌 苏云金杆菌的伴孢晶体内含有杀死鳞翅苏云金杆菌的伴孢晶体内含有杀死鳞翅目昆虫的毒素目昆虫的毒素 毒性蛋白质抗虫基因提取出来，用基因毒性蛋白质抗虫基因提取出来，用基因工程技术转接到小麦、水稻、棉花植株工程技术转接到小麦、水稻、棉花植株中，进行基因重组，使其具有抗虫、杀中，进行基因重组，使其具有抗虫、杀虫能力虫能力。微生物与植物之间的基因工程微生物与植物之间的基因工程 Research progress of engineerin

39、g bacteria in environmental harness and protection 2003年05期常春,梁超介绍了目前环境治理与保护中工程菌,特别是基因工程菌的研制方法、应用情况以及各国生物安全管理办法.动物基因工程 发光蛋白：水母和珊瑚虫 水母绿色荧光蛋白，1922年基因克隆出来，转基因荧光斑马鱼，紫外光照射下能发出绿光。给发光蛋白基因加上“开关”启动子，用以检测环境中的重金属、毒素、激素等。第六节 PCR技术在环境工程中的应用 PCR(polymerase chain reaction)聚合酶链反应，是一种体外快速扩增特定DNA序列的新技术。在模板DNA、引物和dNTPs存在的情况下，DNA聚合酶（Taq酶）依赖的酶促反应 dNTPs(脱氧核苷三磷酸）：dATPs dTTPs dGTPs dCTPs的总称 Mg2+、合适pH缓冲液