荧光化学发光在植物分子生物学的应用课件.ppt

1、2022-11-22荧光化学发光在植物分子生物学的应用荧光化学发光在植物分荧光化学发光在植物分子生物学的应用子生物学的应用荧光化学发光在植物分子生物学的应用OutlineOutline 1 1、荧光技术、荧光技术 2 2、化学发光技术、化学发光技术荧光化学发光在植物分子生物学的应用1 1、荧光技术、荧光技术荧光化学发光在植物分子生物学的应用荧光技术的分类荧光技术的分类荧光强度时间分辨荧光荧光偏振荧光共振能量传递均相时间分辨荧光荧光化学发光在植物分子生物学的应用1 1）荧光强度（）荧光强度（FIFI）S1inner orbitalouter orbitalnucleousExcitation S

2、ignal Ex EmSoEmission Signal荧光化学发光在植物分子生物学的应用FIFI应用的优势应用的优势灵敏度高，使用方便、安全可以灵活地利用各种类型的荧光探针和荧光染料对目标物质进行特异性标记，大大减少杂质的信号干扰可以进行活细胞或活体检测（细胞毒性小）可以进行多重专一性标记（如蓝色细胞核/红色线粒体）荧光化学发光在植物分子生物学的应用FIFI应用范围应用范围生物大分子的定量分析生物大分子的定量分析核酸、蛋白质酶活性分析酶活性分析糖甘酶、蛋白酶、脱氢酶、过氧化物酶钙流检测钙流检测报告基因检测（报告基因检测（GFPGFP）荧光化学发光在植物分子生物学的应用FIFI应用核酸定量分析

3、应用核酸定量分析PicogreenPicogreen荧光染料荧光染料可以排除蛋白质等的信号干扰（用于检测蛋白质样品中的微量核酸）Arabidopsis Chromatin DNAThe Plant Cell,18461858,2003(15)Tobacco RNAThe Plant Cell,22032217,2003(15)荧光化学发光在植物分子生物学的应用FI应用糖苷酶活性分析应用糖苷酶活性分析b-D-glucosidase 4-MUb-D-glucopyranoside b-D-fucosidase 4-MUb-D-fucoside Decreased Glucosidase and F

4、ucosidase Activity in nai1-1 and nai1-2 Arabidopsis Mutants.(Plant Cell,15361549,2004-16)荧光化学发光在植物分子生物学的应用FIFI应用蛋白酶活性分析应用蛋白酶活性分析Fractionation of Soybean Proteases after Oxidative Stress.(H2O2 treated vs.control)(Plant Cell,431443,1999-11)Arginine-specific Protease Z-Gly-Gly-Arg-AMC荧光化学发光在植物分子生物学的应用F

5、IFI应用的局限性应用的局限性背景荧光干扰背景荧光干扰微孔板的自发荧光微孔板的自发荧光细胞的内源荧光细胞的内源荧光荧光化学发光在植物分子生物学的应用2 2）时间分辨荧光（）时间分辨荧光（TRFTRF）Elapsed TimeIntensity ExcitationAutoFluorescenceFluorescein Emission Europium EmissionLong Decay Time.-Measurement-利用时间特性达到超高灵敏度利用时间特性达到超高灵敏度荧光化学发光在植物分子生物学的应用Europium ion镧系元素镧系元素镧系元素螯合物镧系元素螯合物时间分辨荧光素镧

6、系元素螯合物时间分辨荧光素镧系元素螯合物荧光化学发光在植物分子生物学的应用孵育孵育(结合结合)洗涤（去除非结合）洗涤（去除非结合）检测检测 缺点：需洗涤；洗涤强度很难一致，结果重复性差。缺点：需洗涤；洗涤强度很难一致，结果重复性差。FI/TRFFI/TRF应用的局限性（非均相技术）应用的局限性（非均相技术）荧光化学发光在植物分子生物学的应用 荧光偏振（FP）荧光共振能量转移（FRET）均相时间分辨荧光（HTRF）均相技术的优势均相技术的优势孵育孵育(结合结合)检测检测 优点：无需洗涤；均一性、重复性好“Add,Mix,and Read”荧光化学发光在植物分子生物学的应用3 3）荧光偏振（）荧光

7、偏振（FPFP）PolarizerAnalyzer偏振光偏振光荧光化学发光在植物分子生物学的应用荧光分子运动荧光分子静止100%0%荧光偏振（荧光偏振（FPFP）原理）原理0%荧光偏振是一种测量分子旋转速率的技术荧光偏振是一种测量分子旋转速率的技术。P =I|+I|_I|I|_荧光化学发光在植物分子生物学的应用标记的配体(低偏振值）目标分子与标记的配体结合 （高偏振值）FPFP应用方式偏振值与分子大小的关系应用方式偏振值与分子大小的关系荧光化学发光在植物分子生物学的应用FPFP应用的优势应用的优势 均相均相(无分离无分离/洗涤），在溶液中测量洗涤），在溶液中测量；可以实时检测；可以实时检测（动

8、力学检测）；快速，容易实现高通量（动力学检测）；快速，容易实现高通量 测量的是比值，结果与荧光基团的绝对浓度无关测量的是比值，结果与荧光基团的绝对浓度无关荧光化学发光在植物分子生物学的应用FPFP应用范围应用范围 受体配体相互作用受体配体相互作用 多肽蛋白质结合多肽蛋白质结合 蛋白质蛋白质核酸结合核酸结合 酶活性分析酶活性分析 淀粉酶、蛋白酶、磷酸激酶、磷酸酶荧光化学发光在植物分子生物学的应用fragmentsAmylaseAmyloseFPFP应用淀粉酶活性分析应用淀粉酶活性分析 荧光标记的荧光标记的AmyloseAmylose被分解成小片段被分解成小片段(偏振值下降偏振值下降)淀粉酶会促进

9、生物体内淀粉粒的降解，进而产生更多的能量物质，来响应某些环境刺激或促进种子萌发。荧光化学发光在植物分子生物学的应用FPFP应用的应用的局限性局限性 使用具有较短寿命的荧光素（如使用具有较短寿命的荧光素（如Fluorescein）依赖于分子结合造成的分子体积的显著改变依赖于分子结合造成的分子体积的显著改变LARGE molecule荧光化学发光在植物分子生物学的应用4 4）荧光共振能量传递（）荧光共振能量传递（FRETFRET）Binding NO Binding荧光化学发光在植物分子生物学的应用均相检测（无分离和洗涤步骤）均相检测（无分离和洗涤步骤）实时连续地观察活细胞的动态变化实时连续地观察

10、活细胞的动态变化FRETFRET应用的应用的优势优势荧光化学发光在植物分子生物学的应用FRETFRET应用范围应用范围酶活性分析酶活性分析蛋白酶、磷酸激酶蛋白质蛋白质核酸相互作用核酸相互作用酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的复证酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的复证钙流检测、离子通道研究钙流检测、离子通道研究蛋白质的结构研究蛋白质的结构研究荧光化学发光在植物分子生物学的应用FRETFRET应用钙流检测应用钙流检测以荧光蛋白为基础的以荧光蛋白为基础的Ca2+sensor供体：供体：CFPCFP受体：受体：YFPYFP荧光化学发光在植物分子生物学的应用 Guard cell Gua

11、rd cell（ArabidopsisArabidopsis）胞浆钙离子动态）胞浆钙离子动态 (Plant J,1999-19,p735-747)(Plant J,1999-19,p735-747)FRETFRET应用示例钙流检测应用示例钙流检测荧光化学发光在植物分子生物学的应用FRETFRET应用胞内激酶活性分析应用胞内激酶活性分析Indicators for protein phosphorylation in living cells 已知蛋白激酶特异性的底物结构域 磷酸化识别结构域蛋白质磷酸化是信号转蛋白质磷酸化是信号转导过程中的重要标志导过程中的重要标志 荧光化学发光在植物分子生物学

12、的应用FRETFRET应用的应用的局限性局限性信噪比经常不佳，通常为信噪比经常不佳，通常为1 1：1 1 -背景主要来自受体被直接激发的信号背景主要来自受体被直接激发的信号荧光化学发光在植物分子生物学的应用供体：镧系元素螯合物供体：镧系元素螯合物受体：受体：XL665XL6655 5）均相时间分辨荧光（）均相时间分辨荧光（HTRFHTRF）荧光化学发光在植物分子生物学的应用PAPCExcitationat 320nmEmissionat 665nmTimeIntensityHTRFHTRF应用应用的优势灵敏度更高的的优势灵敏度更高的FRETFRETPYenergy transferAPCEuE

13、xcitationat 320nmEmissionat 665nmTimeIntensity荧光化学发光在植物分子生物学的应用2 2、化学发光技术、化学发光技术荧光化学发光在植物分子生物学的应用化学发光技术的分类化学发光技术的分类 发光 发光共振能量传递荧光化学发光在植物分子生物学的应用1 1）发光（）发光（LumLum）SubstrateProduct+LightEnzyme优势：超高灵敏度优势：超高灵敏度荧光化学发光在植物分子生物学的应用LumLum应用范围应用范围钙流检测钙流检测基因调控基因调控ATPATP检测检测发光免疫分析发光免疫分析荧光化学发光在植物分子生物学的应用发光应用钙流检测

14、发光应用钙流检测 水母发光蛋白水母发光蛋白AequorinCa+荧光化学发光在植物分子生物学的应用Kinetics of the-glucan（葡聚糖）elicitor-induced enhancement of the Ca2+cyt in soybean cells.（Biological Procedures Online 2002-4/1,p105-118）发光应用示例钙流检测发光应用示例钙流检测荧光化学发光在植物分子生物学的应用发光应用基因调控发光应用基因调控pSP-luc+(转化拟南芥细胞转化拟南芥细胞)荧光化学发光在植物分子生物学的应用Cultured cells show d

15、iurnal rhythms(Arabidopsis)(Plant Cell Physiol,2004-45/1,p57-67)CCA1的启动子区域的启动子区域CCA1在昼夜节律调节起中心作用的转录因子在昼夜节律调节起中心作用的转录因子发光应用示例基因调控发光应用示例基因调控荧光化学发光在植物分子生物学的应用2 2）发光共振能量传递（）发光共振能量传递（BRETBRET）Donor=Renilla luciferase(Rluc)Donor=Renilla luciferase(Rluc)Acceptor=YFPAcceptor=YFP荧光化学发光在植物分子生物学的应用BRETBRET应用范围

16、应用范围 蛋白组学蛋白组学:蛋白-蛋白相互作用 胞内细胞器间的相互作用 对酵母双杂交结果的验证 受体研究受体研究:受体的同源和异源二聚体化 受体应答传导途径 孤儿受体的筛选荧光化学发光在植物分子生物学的应用BRETBRET应用示例蛋白质相互作用应用示例蛋白质相互作用 发光光谱发光光谱（关注（关注530/480 ratio）COP1的二聚体化的二聚体化COP1-光形态建成的关键抑制因子荧光化学发光在植物分子生物学的应用COP1蛋白突变体的二聚体化研究蛋白突变体的二聚体化研究 (PNAS,2004-101/17,p67986802)BRETBRET应用示例蛋白质相互作用应用示例蛋白质相互作用cyt

17、oplasmic localization signal(CLS)荧光化学发光在植物分子生物学的应用技术总结技术总结荧光技术荧光技术 利用荧光物质进行特异性标记；特异性好，灵敏度高；特别适合于细胞研究和分子间相互作用研究。发光技术发光技术 灵敏度超高，特别适合于基因表达和基因调控研究。荧光化学发光在植物分子生物学的应用TecanTecan多功能酶标仪家族多功能酶标仪家族针对各种光检测技术的针对各种光检测技术的Total SolutionTotal Solution通用型检测系统通用型检测系统功能全面的滤光片型检测系统功能全面的滤光片型检测系统独一无二的全光谱扫描型检测系统独一无二的全光谱扫描型检测系统荧光化学发光在植物分子生物学的应用384964824126多功能酶标仪多功能酶标仪支持的微孔板类型支持的微孔板类型1536从从6孔孔-48孔的细胞培养板、孔的细胞培养板、96孔酶标板到孔酶标板到384、1536板等高密度筛选板板等高密度筛选板2022-11-22荧光化学发光在植物分子生物学的应用