水质微生物检测课件.ppt

1、第十二章 水质微生物检测第一节 水中微生物一、水生境的特征影响水中微生物分布类群的主要因素：温度静水压光照溶解氧氢离子强度化学物质营养物质 光照：日光中紫外线射入水中强度明显减弱，具有光合作用的微生物和藻类主要分布在水的表层；溶解氧：水中的需氧微生物利用溶解氧，水体表层主要是需氧和兼性需氧微生物，深层和水底以厌氧微生物为主；PH：水中微生物适宜范围是pH6.58.5，这与一般自然水的pH值范围相适应。海水的pH7.58.5，海水中多数微生物生长的最适pH7.27.6；化学物质：有机物，无机物：氨、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐，金属离子：汞、铜；营养物质：异养微生物，营养贫乏时，微生物倾向吸附

2、颗粒。二、水微生物的种类 水微生物的种类很多，有细菌、真菌、病毒、藻类和原生动物；水中大多数微生物属于异养微生物，它能利用水中有机物质生长，另一类为自养微生物，它只需无机物质就能合成新的细胞。三、水中细菌的特点 个体小；多有鞭毛和纤毛能运动；常聚集在一起，或粘附于颗粒物质表面能耐受低浓度的营养物质；多为革兰阴性菌。四、水微生物的卫生学意义1、引起介水传染病水是传染性疾病的重要传播途径。病原体进入水体后可能导致介水传染病的传播和流行；2、污染食品引起感染水生微生物还会使水产品和水生生物受到污染，人在食用后也可引起感染；3、污染食品引起食品腐败变质即使污染的不是致病微生物，也有可能引起食品腐败变质

3、，间接影响人类健康。第二节饮用水种类及卫生微生物指标一、饮用水分类1、生活饮用水：供人生活的饮水和生活用水2、包装饮用水：饮用天然矿泉水 饮用天然泉水 其他天然饮用水 饮用纯净水 饮用矿物质水 其他包装饮用水二、饮用水介绍（一）、生活饮用水 新发布的产品标准 GB5749-2006 标准检验方法为 GB/T5750-2006 水质检验项目由原35项增加至106项，旧标准微生物指标只有细菌总数和总大肠菌群2项，不能确切的评价水质的卫生状况。修订后的微生物学指标增加为6项：菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫和隐孢子虫。（二）包装饮用水1、饮用天然矿泉水新发布的产品标准GB

4、8537-2008饮用天然矿泉水标准检验方法为GB/T 8538-2008饮用天然矿泉水检验方法取消了菌落总数，增加了三个新的致病菌粪链球菌、铜绿假单胞菌和产气荚膜梭菌，加上大肠菌群共4项微生物指标；2、饮用天然泉水 除矿物质指标不能达到饮用天然矿泉水的要求外，其余从开采、水源保护、加工工艺等都应与矿泉水保持一致。国家标准起草中，一般可参考GB19298-2003，微生物学指标为4项：菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母、致病菌（沙门、志贺、金葡）；3、其他天然饮用水对于来源于井水、水库水、溪流、湖泊、高山冰川等，未受污染，未经公共供水系统的水，可以称为“天然”。国家标准起草中，一般可参考GB192

5、98-2003，微生物学指标为4项：菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母、致病菌（沙门、志贺、金葡）；4、饮用纯净水经过反渗透、电渗析等水处理工艺的产品。产品标准为GB17323 瓶装饮用纯净水和GB17323 瓶装饮用纯净水卫生标准，微生物学指标为4项：菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母、致病菌（沙门、志贺、金葡）要求高于GB19298-2003；5、饮用矿物质水强化矿物质成分的一种水，也有叫矿化水，国家标准起草中；6、其他包装饮用水调味水，不经调色，增加各种香精风味。三、与水质相关的各类标准和检验方法v GB5749-2006，生活饮用水卫生标准vGB/T5750-2006，生活饮用水标准检验方法v

6、GB85372008，饮用天然矿泉水v GB/T85382008，饮用天然矿泉水检验方法v GB173231998，瓶装饮用纯净水v GB173242003，瓶装饮用纯净水卫生标准v GB192982003，瓶（桶）装饮用水卫生标准 四、各类水质的微生物指标要求 各类水质的微生物指标要求(续)第三节生活饮用水微生物检测一、水样中微生物项目检测方法 GB/T 5750.121 菌落总数 1 平皿计数法2 总大肠菌群 1 多管发酵法 2 滤膜法 3 酶底物法3 耐热大肠菌群 1 多管发酵法 2 滤膜法 4大肠埃希氏菌 1 多管发酵法 2 滤膜法 3 酶底物法5贾第鞭毛虫和隐孢子虫 免疫磁分离荧光抗

7、体法二、水样的采集和保存方法GB/T 5750.21、水样的采集方法 范围：适用于生活饮用水和及其水源水样的采集和保存 采样容器：玻璃材质，不透明非活性玻璃容器。容器及塞子、盖子应经灭菌温度并且在此温度下不释放或产生出任何能抑制生物活性、灭活或促进生物生长的化学物质。取样体积：0.5L采样容器的洗涤和灭菌：1）容器洗涤：将容器用自来水和洗涤剂洗涤，并且用自来水彻底冲洗后用质量分数为10的盐酸溶液浸泡过夜，然后依次用自来水，蒸馏水洗净；2）容器灭菌：热力灭菌。干热灭菌要求160，2h；高压蒸汽灭菌121，15min。高压蒸汽灭菌后的容器如不立即使用，应于60将瓶内冷凝水烘干，灭菌后的容器应在2周

8、内使用。3）同一水源，同一时间采集几类检测指标的水样时，应先采集供微生物学指标检测的水样，采样时应直接采集，不得用水样涮洗已灭菌的采样瓶，并避免手指和其他物品对瓶口的污染。4）在取自来水样时，先用酒精灯将水龙头烧灼消毒，然后把水龙头完全打开，放水几分钟后，再取水样。5）采取含有余氯的水样时，应在水样瓶未消毒前按每125ml水样加入0.1mg硫代硫酸钠除去残余余氯。2、水样保存 各种水质的水样，从采集到分析这段时间里，由于物理的、化学的、生物的作用会发生不同程度的变化，这些变化使得进行分析时的样品已不再是采样时的样品，为了使这种变化降低到最小的程度，必须在采样时对样品加以保护。微生物：04避光保

9、存，每125ml水样加入0.1mg硫代硫酸钠除去残余余氯，保存时间4h。3、水样的过滤和离心 需要进行微生物检测的样品，不能进行过滤和离心。三、细菌菌落总数检测1.方法平皿计数法2.范围：此方法适用于测定生活饮用水及其水源水中的细菌总数 3.定义:菌落总数（standard plate-count bacteria）水样在营养琼脂上有氧条件下37培养48h后，所得1mL水样所含细菌的总数。4.主要培养基：营养琼脂5.主要仪器：培养箱36+1 等6.检验步骤 生活饮用水 1mL水样+15mL45左右琼脂，摇匀，做平行样和空白对照。冷却后，翻转平板，36+1 培养48h后计数。水源水 先制成1：1

10、0，1：100等稀释液，再按生活饮用水的检验步骤进行检验。生活饮用水生活饮用水生活饮用水菌落总数检测操作流程生活饮用水菌落总数检测操作流程7.菌落计数及报告方法 作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此平皿计数后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。8.不同稀释度的选择及报告方法首选30300之间

11、进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1实例1）；若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数（见表1实例2），若大于或等于2则报告其中稀释度较小的菌落数（见表1实例3、4）；若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1实例5）；若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1实例6）；若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1实例

12、7）；若所以稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之；如果所以平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个平板1cm2中的菌落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿底面积63.6cm2，再乘其稀释倍数作报告；菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。表1 稀释度选择及菌落总数报告方式实例实例不同稀释度的平均菌落数不同稀释度的平均菌落数两个稀释度两个稀释度菌落数之比菌落数之比菌落总数菌落总数/（CFU/mL）报告方式报告

13、方式/(CFU/mL)1010-1-11010-2-21010-3-31 113651365164164202016400164001600016000或或1.6104 42 22760276029529546461.61.637750377503800038000或或3.8104 43 32890289027127160602.22.227100271002700027000或或2.7104 44 415015030308 82 21500150015001500或或1.5103 35 5多不可计多不可计16501650513513513000513000510000510000或或5.11

14、05 56 6272711115 5270270270270或或2.7102 27 7多不可计多不可计305305121230500305003100031000或或3.1104 48 80 00 00 0 l ll0 l0 l ll0l0四、总大肠菌群检测1.方法多管发酵法（另有滤膜法和酶底物法）2.定义 总大肠菌群（total coliforms）指一群在37培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。3.主要培养基：乳糖蛋白胨培养液、伊红美兰培养基和革兰氏染液。4.主要仪器：培养箱、平皿和试管等。5.检验步骤乳糖发酵试验 取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白

15、胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样注入9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL（即0.1mL水样）注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接接种5份10mL水样双料培养基，每份接种10mL水样。检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1，0.1，0.01mL甚至0.1，0.01，0.001mL，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌刻度吸管。接种管置36+1 培养箱内，培养24

16、h+2h后,如所有乳糖蛋白胨培养管都不产酸产气，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。分离培养 将产酸产气的发酵管分别转钟在伊红美兰琼脂平板上，于36+1培养箱内培养18h24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰染色、镜检和证实试验。深紫黑色、具有金属光泽的菌落；紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色、中心较深的菌落。大肠菌群在乳糖发酵管乳糖发酵管发酵结果 阳性阳性阴性证实试验 经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36+1培养箱内培养24h+2h,有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。总大肠菌群检测操作流程6.结果报告查表 根据

17、证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN（most probable number,最可能数）检索表，报告每100mL水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。5管法结果见表2,15管结果见表3.稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。如所有乳糖发酵管均为阴性时，可报告总大肠菌群未检出。表2 用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数（MPN）5 5个个10mL管中阳性管数管中阳性管数最可能数（最可能数（MPN）0 02.21 12.22.22 25.15.13 39.29.24 416.016.05 51616五、耐热大肠菌群检测1.方法多管发酵法（另有滤膜法）2.定义 耐热大肠菌群（th

18、ermotolerant coliform bacteria）用提高培养温度的方法将自然环境汇中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5 仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。3.主要培养基：EC培养基和伊红美兰琼脂4.主要仪器：恒温水浴培养箱5.检验步骤 1）自总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管（产酸产气）中取1滴转钟于EC培养基中，置44.5 水浴箱或隔水式恒温培养箱内（水浴箱的水面应高于试管中培养液面），培养24 h+2h后，如所有管均不产气，则可报告为阴性，如有产气者，则转钟于伊红美兰琼脂平板上，置44.5 培养18h24h，凡平板上有典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群阳性。2）如检

19、测未经氯化消毒的水，且只想检测耐热大肠菌群时，或调查水源水的耐热大肠菌污染时，可直接多管耐热大肠菌群方法，即在第一步乳糖发酵试验时按总大肠菌群接种乳糖蛋白胨培养液在44.5 +0.5 水浴中培养。6.结果报告根据证实为耐热大肠菌群的阳性管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每100mL水样中耐热大肠菌群的最可能值。7、耐热大肠菌群的卫生学意义1）作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。2）通常情况下耐热大肠菌群与总大肠菌群相比，在人和动物粪便中所占的比例较大，而

20、且由于在自然界容易死亡等原因，耐热大肠菌群的存在可认为近期水体直接或间接地受到了粪便污染。因而，与总大肠菌群相比，耐热大肠菌群在水体中的检出，说明水体更为不清洁，存在肠道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。3）耐热大肠菌群是总大肠菌群的一部分将培养温度提高到4445，在此条件下仍能生长和发酵乳糖的菌群被称为耐热大肠菌群。它们由埃希氏菌属以及克雷伯菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属中的一些菌种组成。这些生物中只有埃希氏大肠杆菌是粪源特异性的，就是指通常大量存在于人类、其它哺乳动物和鸟类粪便中，很少在不是粪便污染主体的土壤和水中发现 耐热大肠菌群在供水系统中再繁殖是不可能的，除非管网中有充足的营养物质(生化

21、需氧量(BOD)超过10mgL)或者不合适的物质接触到处理后的水，水温超过15，以及管网中没有游离余氯。4）从这些参数的含义可以知道他们的可能联系是，在硝酸盐氮,氨氮,耗氧量较高时，水体污染程度较大，其相应的卫生指标总大肠菌群,耐热大肠菌群也比较高，这主要是针对生活污水而言的，因此这种关系在其他类废水中不一定存在。六、大肠埃希氏菌检测多管发酵法：七、两虫检测方法简介两虫：贾第鞭毛虫和隐孢子虫两虫：贾第鞭毛虫和隐孢子虫检测方法：免疫磁分离荧光抗体法（GB/T 5750-2006）原理：利用滤筒过滤富集水样中的隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊，接着用免疫磁珠分离技术将隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊与杂质分开，然后利用免疫荧光技术对两虫进行染色，并借助荧光和微分干涉显微镜进行镜检和计数。八、生活饮用水中微生物指标项目单位限值说明总大肠菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得检出一般性污染耐热大肠菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得检出指示粪便污染大肠埃希氏菌MPN/100mL或CFU/100mL不得检出指示粪便污染菌落总数CFU/mL100一般性污染贾第鞭毛虫个/10 L1肠道原虫隐孢子虫个/10 L1肠道原虫