生物催化与生物转化IV课件.ppt
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- 生物 催化 生物转化 IV 课件
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1、Chapter 11 Modification of Enzyme Molecule酶的分子修饰酶的分子修饰Contents of chapter 111、什么是酶分子修饰2、酶分子修饰的基本要求和条件3、酶分子的修饰方法4、酶修饰后的性质变化GoGoGoGo5、酶的定向进化Go11.1 11.1 什么是酶分子修饰?什么是酶分子修饰?通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即:在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团(物质),特别是具有生物相容性的物
2、质,进行共价连接,从而改变酶的结构和性质。酶分子修饰的意义 提高酶的活力活力 activity activity 增强酶的稳定性稳定性 stability stability 降低或消除酶的抗原性抗原性 immunological property immunological property 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structurestructure 回本章目录11.2 酶分子修饰的基本要求和条件酶分子修饰的基本要求和条件 对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以
3、及酶学性质等方面都要有足够的了解。选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。(1 1)酶的稳定性酶的稳定性 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pHpH、抑制剂等。、抑制剂等。(2 2)酶活性中心的状况酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。亚基数等。酶分子修饰的条件酶分子修饰的条件 修饰反应尽可能在修饰反应尽可能在酶稳定条件酶稳定条件下进行,并尽量下进行,并尽量不破坏酶不破坏酶活性功能的必需基团活性功能的必需基团,使,使修饰率高修饰率高,同时酶的,同时酶的活力回收活力回收高高。(1 1)
4、pHpH与离子强度与离子强度 pHpH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同,反应性能也不同。于它们的解离状态不同,反应性能也不同。(2 2)修饰反应的温度与时间修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。一性的修饰反应。(3 3)反应体系中酶与修饰剂的比例反应体系中酶与修饰剂的比例 回本章目录11.3 11.3 酶分子的修饰方法酶分子的修饰方法 金属离子置换修饰金属离子置换修饰,大分子结合修饰大分子结合修饰(共价共价/非共价非共价)侧链基团修饰侧链基团修
5、饰 肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰 酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰(1)(1)酶的金属离子置换修饰酶的金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。-淀粉酶中的钙离子(Ca2+),谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+),过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+),酰基氨基酸酶分子中的锌离子(Zn2+),超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)若从酶分子中除去其所含的金属离子,酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子,酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换,则可
6、使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失,有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。金属离子置换修饰的过程金属离子置换修饰的过程 p a.酶的分离纯化:首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化,除去杂质,获得具有一定纯度的酶液。p b.除去原有的金属离子:在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂,如乙二胺四乙酸(EDTA)等,使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法,将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时,酶往往成为无活性状态。p c.加入置换离子:于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子,酶蛋白与新加入的金属离子结合,除去多余的置换离子,就可以得
7、到经过金属离子置换后的酶。p 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。p 用于金属离子置换修饰的金属离子,一般都是二价金属离子。用于金属离子置换修饰的金属离子,一般都是二价金属离子。(2)(2)酶的大分子修饰酶的大分子修饰使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物,如聚乙二醇、右旋糖苷等,它们既能通过氢键固定在酶分子表面,也能通过氢键有效地与外部水相连,从而保护酶的活力。一些添加物,如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互
8、作用时,其表面区域内排除了水分子,因而增加了相互作用力,其稳定性也就增加了。非共价修饰非共价修饰用可溶性大分子,如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等,通过共价键连接于酶分子的表面,形成一层覆盖层。例如:用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶,不仅可以降低或消除酶的抗原性,而且提高了抗蛋白酶的能力,延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与6.56.5分子的右旋糖酐结合,可以使酶活力提高到原有酶活力的2.252.25倍;每分子胰凝乳蛋白酶与1111分子右旋糖酐结合,酶活力达到原有酶活力的5.15.1倍 共价修饰共价修饰大分子修饰大分子修饰(共价共价)的过程的过程修饰剂的选择修饰剂的选择:大分子结合修
9、饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如,聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、蔗糖聚合物(Ficoll)、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。修饰剂的活化修饰剂的活化:作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化,然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。修饰修饰:将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液,以一定的比例混合,在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间,使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合,对酶分子进行修饰。分离分离:需要通过凝胶层析等方法进行分离,将具
10、有不同修饰度的酶分子分开,从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性,聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性,在体内无毒性、无残留、无免疫原性,并可消除酶的在体内无毒性、无残留、无免疫原性,并可消除酶的抗原性,使其末端活化后可以与酶产生交联,因而,抗原性,使其末端活化后可以与酶产生交联,因而,它被广泛用于酶的修饰。它被广泛用于酶的修饰。酶 半衰期相对稳定性 天然SOD 6 min 1 右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量)SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)SOD 24 h 240 聚乙二醇聚乙二醇-SOD 35 h
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