生物化学第4章方案.ppt
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1、第四章第四章 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构一、蛋白质通论一、蛋白质通论二、肽二、肽三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能五、肽与蛋白质的人工合成五、肽与蛋白质的人工合成一、蛋白质通论一、蛋白质通论蛋白质蛋白质(Protein)(Protein)是生物体的基本组成成份。在人体内蛋白是生物体的基本组成成份。在人体内蛋白质的含量很多,约占人体固体成分的质的含量很多,约占人体固体成分的45%45%,它的分布很广,它的分布很广,几乎所有的器官组织都含蛋白质,并且它又与所有的生命活几乎所有的器官组织都含蛋白质,并且它又与所有的生
2、命活动密切联系。动密切联系。机体新陈代谢过程中的一系列化学反应几乎都依赖于生物催化剂酶机体新陈代谢过程中的一系列化学反应几乎都依赖于生物催化剂酶的作用,而酶的本质就是蛋白质;调节物质代谢的激素有许多也是蛋的作用,而酶的本质就是蛋白质;调节物质代谢的激素有许多也是蛋白质或它的衍生物;其它诸如肌肉的收缩,血液的凝固,免疫功能,白质或它的衍生物;其它诸如肌肉的收缩,血液的凝固,免疫功能,组织修复以及生长、繁殖等主要功能无一不与蛋白质相关。近代分子组织修复以及生长、繁殖等主要功能无一不与蛋白质相关。近代分子生物学的研究表明,蛋白质在遗传信息的控制、细胞膜的通透性、神生物学的研究表明,蛋白质在遗传信息的
3、控制、细胞膜的通透性、神经冲动的发生和传导以及高等动物的记忆等方面都起着重要的作用。经冲动的发生和传导以及高等动物的记忆等方面都起着重要的作用。(一)蛋白质的化学组成和分类(一)蛋白质的化学组成和分类单纯蛋白质的元素组成为单纯蛋白质的元素组成为C 50C 5055%55%、H 6%H 6%7%7%、O 19%O 19%24%24%、N 13%N 13%19%19%,除此之外还有,除此之外还有S 0S 04%4%。有的蛋白质含有。有的蛋白质含有P P、I I。少数含少数含FeFe、CuCu、ZnZn、MnMn、CoCo、MoMo等金属元素。等金属元素。各种蛋白质的含氮量很接近,平均为各种蛋白质的
4、含氮量很接近,平均为16%16%。由于体内组织的主。由于体内组织的主要含氮物是蛋白质,因此,只要测定生物样品中的氮含量,要含氮物是蛋白质,因此,只要测定生物样品中的氮含量,就可以按下式推算出蛋白质大致含量:就可以按下式推算出蛋白质大致含量:蛋白质含量蛋白氮蛋白质含量蛋白氮6.256.25 (凯氏(凯氏(Kjedahl)(Kjedahl)定氮法的计算基础)定氮法的计算基础)单纯蛋白质(单纯蛋白质(simple protein)simple protein):仅由氨基酸组成,不含其:仅由氨基酸组成,不含其它化学成分。它化学成分。缀合蛋白质缀合蛋白质(conjugated protein)(conj
5、ugated protein):除含有氨基酸外的各种:除含有氨基酸外的各种化学成分作为其结构的一部分。非蛋白质部分称为化学成分作为其结构的一部分。非蛋白质部分称为辅基辅基(prosthetic group)(prosthetic group)或或配体配体(ligand)(ligand)。单纯蛋白质单纯蛋白质 (按溶解度分类)(按溶解度分类)清蛋白清蛋白球蛋白球蛋白谷蛋白谷蛋白谷醇溶蛋白谷醇溶蛋白组蛋白组蛋白鱼精蛋白鱼精蛋白硬蛋白硬蛋白 缀合蛋白质缀合蛋白质 (按非氨基酸(按非氨基酸 成分分类)成分分类)糖蛋白糖蛋白脂蛋白脂蛋白核蛋白核蛋白磷蛋白磷蛋白金属蛋白金属蛋白血红素蛋白血红素蛋白黄素蛋白
6、黄素蛋白单纯蛋白质分类单纯蛋白质分类结合蛋白质分类结合蛋白质分类 蛋白质蛋白质(按生物学功能分类)(按生物学功能分类)酶酶调节蛋白调节蛋白转运蛋白转运蛋白贮存蛋白贮存蛋白收缩和游动蛋白收缩和游动蛋白结构蛋白结构蛋白支架蛋白支架蛋白保护和开发蛋白保护和开发蛋白异常蛋白异常蛋白(二)蛋白质的形状和大小(二)蛋白质的形状和大小形状形状纤维状纤维状球状球状膜蛋白膜蛋白蛋白质的相对分子量从大约蛋白质的相对分子量从大约600060001 110106 6或更大一些。或更大一些。单体蛋白质单体蛋白质(monomeric(monomeric protein)protein):仅由一条多肽链组成。:仅由一条多肽
7、链组成。其相对分子量除以其相对分子量除以110110估计氨基酸残基的数目。估计氨基酸残基的数目。寡聚蛋白质寡聚蛋白质(oligomeric(oligomeric protein)protein):由两条或多条多肽链:由两条或多条多肽链组成。每条多肽链称为亚基组成。每条多肽链称为亚基(subunit)(subunit)。(三)蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次(三)蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次一级结构一级结构(primary structure)(primary structure):多肽链的氨基酸序列。多肽链的氨基酸序列。二级结构二级结构(secondary structure)(secon
8、dary structure):多肽链中主链原子的局多肽链中主链原子的局部空间排布即构象,不涉及侧链部分的构象。部空间排布即构象,不涉及侧链部分的构象。三级结构三级结构(tertiary structure)(tertiary structure):蛋白质的多肽链在各种二蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折迭形成具有一定规律的三级结构的基础上再进一步盘曲或折迭形成具有一定规律的三维空间结构。维空间结构。四级结构四级结构(quarternary structure)(quarternary structure):具有二条或二条以上具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质
9、,其多肽链间通过次级独立三级结构的多肽链组成的蛋白质,其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构。键相互组合而形成的空间结构。四、蛋白质功能的多样性四、蛋白质功能的多样性 蛋白质的序列异构现象是蛋白质生物功能多样性和物种蛋白质的序列异构现象是蛋白质生物功能多样性和物种特异性的结构基础。特异性的结构基础。蛋白质的生物学功能:蛋白质的生物学功能:1.1.催化;催化;2.2.调节;调节;3.3.转运;转运;4.4.贮存;贮存;5.5.运动;运动;6.6.结构成分;结构成分;7.7.支架作用;支架作用;8.8.防御与进攻;防御与进攻;9.9.异常功能;异常功能;蛋白质(蛋白质(proteinprot
10、ein)是生活细胞内含量最丰富、功能最)是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子,并参与了几乎所有的生命活动和生命过复杂的生物大分子,并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此,研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本程。因此,研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。的命题。生物体最主要的特征是生命活动,而蛋白质是生命活动生物体最主要的特征是生命活动,而蛋白质是生命活动的体现者,具有以下主要功能:的体现者,具有以下主要功能:二、肽二、肽肽是氨基酸的线性聚合物,常称多肽链(肽是氨基酸的线性聚合物,常称多肽链(peptide chainpeptide chain)。)。蛋白质是由
11、一条或多条具有确定的氨基酸序列的多肽链构成蛋白质是由一条或多条具有确定的氨基酸序列的多肽链构成的大分子。的大分子。(一)肽和肽键的结构(一)肽和肽键的结构蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键。蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键。CCNCCNCCNCCNCCH2CHCH2CH2CH2COO-OHCO2HCH2CONH2OHCH3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnCH3N-端C-端肽键肽链写法肽链写法:游离:游离-氨基在左,游离氨基在左,游离-羧基在右,氨基酸之间用羧基在右,氨基酸之间用“-”表示肽键。表示肽键。H2N-丝氨酸丝氨酸-缬氨酸缬氨酸-酪氨酸酪氨酸-
12、天冬氨酸天冬氨酸-谷氨酰氨谷氨酰氨-COOHSer-Val-Tyr-Asp-Gln(S-V-Y-D-Q)由于羰基碳由于羰基碳-氧双键的靠拢,允许存在共振结构(氧双键的靠拢,允许存在共振结构(resonance structureresonance structure),),碳与氮之间的肽键有部分双键性质,由碳与氮之间的肽键有部分双键性质,由CO-NHCO-NH构成的肽单元呈现相对的刚性构成的肽单元呈现相对的刚性和平面化,肽键中的和平面化,肽键中的4 4个原子和它相邻的两个个原子和它相邻的两个-碳原子多处于同一个平面碳原子多处于同一个平面上。上。多肽链可以看成由多肽链可以看成由C C串联起来的无
13、数个酰胺平面组成串联起来的无数个酰胺平面组成共振产生的重要结果:共振产生的重要结果:限制绕肽键的自由旋转限制绕肽键的自由旋转 形成酰胺平面形成酰胺平面 产生键的平均化产生键的平均化 肽键呈反式构型肽键呈反式构型sp2sp2sp2sp3共振杂化体共振杂化体(二)肽的物理和化学性质(二)肽的物理和化学性质短肽的晶体是离子晶格,在水溶液中以偶极离子存在。在短肽的晶体是离子晶格,在水溶液中以偶极离子存在。在pH0-14pH0-14范围内,肽键中的亚氨基不能解离。范围内,肽键中的亚氨基不能解离。小肽的滴定曲线和氨基酸的滴定曲线很相似。小肽的滴定曲线和氨基酸的滴定曲线很相似。肽的化学反应也和氨基酸一样,游
14、离的肽的化学反应也和氨基酸一样,游离的氨基、氨基、羧羧基和基和R R基可以发生与氨基酸中相应的基团类似的反应。双缩基可以发生与氨基酸中相应的基团类似的反应。双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的,而为氨基酸所没有的一个脲反应是肽和蛋白质所特有的,而为氨基酸所没有的一个颜色反应。颜色反应。一般短肽的旋光度约等于组成该肽中各个氨基酸的旋光度一般短肽的旋光度约等于组成该肽中各个氨基酸的旋光度的总和,但较长的肽或蛋白质的旋光度则不能这样简单相的总和,但较长的肽或蛋白质的旋光度则不能这样简单相加。加。(三)天然存在的活性肽(三)天然存在的活性肽生物体内游离存在着很多活性肽,具有各种特殊的生物生物体内游离存在着很
15、多活性肽,具有各种特殊的生物学功能。学功能。激素:催产素、加压素、舒缓激肽激素:催产素、加压素、舒缓激肽抗生素:短杆菌肽、多粘菌素抗生素:短杆菌肽、多粘菌素E E、放线菌素、放线菌素D D蕈的剧毒毒素:蕈的剧毒毒素:鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱还原型谷胱甘肽还原型谷胱甘肽鹅肌肽、肌肽鹅肌肽、肌肽天然肽中含有蛋白质中不存在的天然肽中含有蛋白质中不存在的-肽键、肽键、丙氨酸和丙氨酸和D D型氨基酸。型氨基酸。三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定蛋白质的一级结构指多肽链中的氨基酸序列。蛋白质的一级结构指多肽链中的氨基酸序列。(一)蛋白质测序的策略(一)蛋白质测序的策略 (1)(1)测定蛋白质分子中多
16、肽链的数目。测定蛋白质分子中多肽链的数目。(2)(2)拆分蛋白质分子的多肽链。拆分蛋白质分子的多肽链。(3)(3)测定多肽链的氨基酸组成。测定多肽链的氨基酸组成。(4)(4)分析多肽链的分析多肽链的N N末端和末端和C C末端残基。末端残基。(5)(5)断裂多肽链内的二硫键。断裂多肽链内的二硫键。(6)(6)多肽链断裂成肽段。多肽链断裂成肽段。(7)(7)测定各个肽段的氨基酸顺序。测定各个肽段的氨基酸顺序。(8)(8)确定肽段在多肽链中的次序。确定肽段在多肽链中的次序。(9)(9)确定原多肽链中二硫键的位置。确定原多肽链中二硫键的位置。将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段顺序进行叠联以确定
17、完整的顺序 将肽段分离并测出顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解专一性裂解末端氨基酸测定末端氨基酸测定二硫键拆开二硫键拆开纯蛋白质纯蛋白质(二)(二)N-N-末端和末端和C-C-末端氨基酸残基的鉴定末端氨基酸残基的鉴定1.N-1.N-末端分析末端分析(1 1)DNFBDNFB法;法;(2 2)DNSDNS法法(3 3)PITCPITC法法(4 4)氨肽酶法)氨肽酶法2.C-2.C-末端分析末端分析(1 1)肼解法;)肼解法;(2 2)还原法)还原法(3 3)羧肽酶法)羧肽酶法 SangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下,能够与二硝基氟苯在碱性条件下,能够与肽链肽链N-
18、N-端的游离氨基作用,生成二硝基苯衍生物端的游离氨基作用,生成二硝基苯衍生物(DNPDNP)。)。在酸性条件下水解,得到黄色在酸性条件下水解,得到黄色DNP-DNP-氨基酸。该产物氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色氨基酸可以用色谱法进行鉴定。谱法进行鉴定。O2NFNO2+H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸在碱性条件下,丹磺酰氯(二甲氨基萘磺酰氯)可以与在碱性条件下,丹磺酰氯(二甲氨基萘磺酰氯)可以与N-N-端氨端氨基酸的游离氨基作用
19、,得到丹磺酰氨基酸。基酸的游离氨基作用,得到丹磺酰氨基酸。此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质,检测灵敏度氨基酸有很强的荧光性质,检测灵敏度可以达到可以达到1 1 1010-9-9molmol。N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸 氨肽酶是一种肽链外切酶,它能从多肽氨肽酶是一种肽链外切酶,它能从多肽链的链的N-N-端逐个的向里水解。端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数
20、量,按反应时间和出的氨基酸种类和数量,按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线,从而氨基酸残基释放量作动力学曲线,从而知道蛋白质的知道蛋白质的N-N-末端残基顺序。末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶,水解最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶,水解以亮氨酸残基为以亮氨酸残基为N-N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。此法是多肽链C-C-端氨基酸分析法端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热,C-端氨基酸即从肽链上解离出来,其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。H2NCH CROHNCH CROORnCCH
21、HNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCH CRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸 羧肽酶是一种肽链外切酶,它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶,它能从多肽链的C-C-端逐个的水解端逐个的水解AAAA。根据不同的反应时间测。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量,从出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量,从而知道蛋白质的而知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种:目前常用的羧肽酶有四种:A,B,CA,B,C和和Y Y;A A和和B B来自胰脏;来自胰脏;C C来自柑桔叶;来自柑桔叶;Y Y来自面包酵母。来
22、自面包酵母。羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸残基;末端氨基酸残基;B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末末端残基的肽键。端残基的肽键。(三)二硫桥的断裂(三)二硫桥的断裂断裂二硫桥的主要方法是过甲酸氧化法和巯基化合物还原断裂二硫桥的主要方法是过甲酸氧化法和巯基化合物还原法。法。s ss sHCOOOHHCOOOHSOSO3 3H HSOSO3 3H HS SS SS SS SS SS S胰岛素胰岛素HO-CHHO-CH2 2-CH-CH2 2-SH-SHSHSHSHSHSHSHSHSH
23、SHSHSHSHSCHSCH2 2C00HC00H SCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HICHICH2 2COOHCOOH作用:作用:这些反应可用于巯基的保护这些反应可用于巯基的保护。-OOCCHCH2SHNH3+CH2OCClO-OOCCHCH2SNH3+OCCH2OCH2-OOCCHCH2SNH3+CH2ClICH2CNH2OCH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+(四)氨基酸组(四)氨基酸组成的分析成的分析用于蛋白的氨基酸用于蛋白的氨基酸组成测定的水解
24、方组成测定的水解方法主要是酸水解,法主要是酸水解,同时辅以碱水解。同时辅以碱水解。氨基酸分析仪图谱氨基酸分析仪图谱(五)多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离(五)多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化纯化1.1.酶裂解法酶裂解法胰蛋白酶胰蛋白酶(trypsin)(trypsin)这是最常这是最常用的蛋白水解酶,专一性强,只断用的蛋白水解酶,专一性强,只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。得到的是以的肽键。得到的是以ArgArg或或LysLys为为C-C-末端残基的肽段,肽段数目等于多末端残基的肽段,肽段数目等于多肽链中肽链中ArgArg和和LysLys总数加总数
25、加1 1。为了减少胰蛋白酶的作用位点,可以通过化学修饰将其侧链为了减少胰蛋白酶的作用位点,可以通过化学修饰将其侧链基因保护起来。用马来酸酐可以保护基因保护起来。用马来酸酐可以保护LysLys残基侧链上的残基侧链上的NHNH2 2,胰蛋白酶就不会水解,胰蛋白酶就不会水解LysLys竣基参与形成的肽键,只能断竣基参与形成的肽键,只能断裂裂ArgArg羧基所形成的肽键;反之,如果用羧基所形成的肽键;反之,如果用1 1,2 2环己二酮修饰环己二酮修饰ArgArg的胍基,则胰蛋白面只能裂解的胍基,则胰蛋白面只能裂解LysLys羧基所形成的肽键。羧基所形成的肽键。如果想增加多肽链中胰蛋白酶的断裂点,可以用
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