生物化学I-第14章-核酸的物理化学性质—第15章-核酸的研究方法课件.ppt

1、第第14章章 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质第一节第一节 核酸的水解核酸的水解 核酸核酸核苷酸核苷酸磷酸磷酸核苷核苷戊糖戊糖碱基碱基水水解解一、酸水解一、酸水解 水解水解特点：特点：1.糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解 2.但糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解但糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解 3.嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定更不稳定 二、碱水解二、碱水解 水解水解特点：特点：1.RNA的磷酸酯键易被碱水解；而的磷酸酯键易被碱水解；而DNADNA对碱稳定对碱稳定H2O磷酸三酯三、酶水解三、酶水解 专一水解核酸的专一水解核酸的磷

2、酸二酯酶磷酸二酯酶称为核酸酶称为核酸酶（nuclease)；水解核酸的酶种类很多水解核酸的酶种类很多 1核酸酶的分类核酸酶的分类 (1)按底物专一性分按底物专一性分 核糖核酸酶核糖核酸酶(RNase)：作用于：作用于RNA 脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶(DNase)：作用于：作用于DNA。(2)按对底物作用的方式按对底物作用的方式 核酸内切酶核酸内切酶(endonuclease)核酸外切酶核酸外切酶(exonuclease)既可内切，也能外切既可内切，也能外切 的核酸酶的核酸酶(3)按磷酸二酯键断裂的方式按磷酸二酯键断裂的方式 在在3-OH与磷酸基之间断裂与磷酸基之间断裂 在在5-OH与磷酸基

3、之间断裂与磷酸基之间断裂 2核糖核酸酶类核糖核酸酶类 (1)牛胰核糖核酸酶牛胰核糖核酸酶；简称；简称RNaseI或或 RNaseA；只作用于只作用于RNA，不作用于，不作用于DNA。十分耐热。十分耐热。具有极高专一性的内切酶，其作用点为：具有极高专一性的内切酶，其作用点为：嘧啶嘧啶核苷核苷-3-3-磷酸与其他核苷酸之间的连键磷酸与其他核苷酸之间的连键，产，产物为物为3-P-3-P-嘧啶核苷酸嘧啶核苷酸 3脱氧核糖核酸酶类脱氧核糖核酸酶类 (1)牛胰脱氧核糖核酸酶（牛胰脱氧核糖核酸酶（DNasel)：此此内切酶切断双链内切酶切断双链DNA或单链或单链DNA成为以成为以5-磷酸为末端的磷酸为末端的

4、寡寡聚核苷酸聚核苷酸。需镁离子。需镁离子(或或Mn2+，Co2+)，最适，最适pH 7-8。(2)牛脾脱氧核糖核酸酶（牛脾脱氧核糖核酸酶（DNase)：此此酶降解酶降解DNA成为成为3-磷酸末端的磷酸末端的寡寡聚核聚核苷酸苷酸。最适。最适pH 45，需，需0.3 molL钠离钠离子激活，镁离子可以抑制此酶。子激活，镁离子可以抑制此酶。(3)限制性内切酶限制性内切酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原

5、核生物中分离纯化出来的。核生物中分离纯化出来的。根据根据1994年美国出版的年美国出版的分子生物学百科分子生物学百科全书全书的统计数字，仅的统计数字，仅型核酸内切限制酶一型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出了了2300种以上。种以上。在上世纪中在上世纪中期，以期，以Arber等人等人对入噬菌体对入噬菌体在大肠杆菌在大肠杆菌不同菌株上不同菌株上的平板培养的平板培养效应的研究效应的研究为基础，发为基础，发现了原核生现了原核生物体内存在物体内存在着寄生控制着寄生控制的的限制限制和和修修饰饰系统。系统。核酸内切限制酶的类型核酸内切限制酶的类

6、型 特性特性I型型II型型III型型限制和修饰限制和修饰活性活性单一多功能单一多功能的酶的酶分开的核酸分开的核酸内切酶和甲内切酶和甲基化酶基化酶 具有一种共具有一种共同亚基的双同亚基的双功能的酶功能的酶核酸限制内核酸限制内切酶的蛋白切酶的蛋白质结构质结构3种不同的种不同的亚基亚基单一的成份单一的成份 2种不同的种不同的亚基亚基 切割位点切割位点在距特异性位在距特异性位点至少点至少1000bp的地方可能随的地方可能随机地切割机地切割位于特异性位位于特异性位点或其附近点或其附近 距特异性位点距特异性位点3，端端2426bp处处甲基化作用的甲基化作用的位点位点特异性的位点特异性的位点特异性的位点；特

7、异性的位点；一般为一般为A或或C特异性的位点特异性的位点识别未甲基化识别未甲基化的序列进行核的序列进行核酸内切酶切割酸内切酶切割 能能 能能能能序列特异的切序列特异的切割割不是不是是是是是DNA克隆中的克隆中的用处用处无用无用十分有用十分有用用处不大用处不大型核酸限制性内切酶的基本特性型核酸限制性内切酶的基本特性它具有三个基本特性：它具有三个基本特性：a.在在DNA分子双链的分子双链的特异性识别序列特异性识别序列部位，部位，切割切割DNA分子产生链的断裂；分子产生链的断裂；b.2个单链断裂部位在个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；常不是彼此直接相对的；c

8、.因此，断裂形成的因此，断裂形成的DNA片段具有互补的单片段具有互补的单链延伸末端。链延伸末端。a.识别位点：识别位点：能够识别由能够识别由48个核苷酸个核苷酸组成的特定的组成的特定的核苷酸序列；核苷酸序列；切割位点切割位点的一个的一个共同特点共同特点是，它们是，它们具有具有双重旋转对称双重旋转对称的结构形式，换言之，这的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈些核苷酸对的顺序是呈回文结构回文结构。5-CTGCA G-3,5-CTGCA G-3,（a）Pst I切割位点切割位点,切割后形成切割后形成3-OH的单链粘性末端，的单链粘性末端，3-G ACGTC-5，3-G +ACGTC-5，(b)

9、EcoRI切割位点切割位点,切割后形成切割后形成5-P的单链粘性末端，的单链粘性末端，5-G AATTC-3 5-G +AATTC-33-CTTAA G-5 3-CTTAA G-5 （c）EcoRV切割位点切割位点,切割后形成平末端。切割后形成平末端。5-GAT ATC-3 5-GAT +ATC-33-CTA TAG-5 3-CTA TAG-5核酸内切限制酶的命名法核酸内切限制酶的命名法（1）用）用属名属名的头一个字母和的头一个字母和种名种名的头两个字的头两个字母，组成母，组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如，大肠杆菌称。例如，大肠杆菌(Escherich

10、ia coli)用用Eco表表示，流感嗜血菌示，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用用Hin表示。表示。（2）用一个写在右下方的标注字母代表）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或菌株或型型，例如，例如Ecok。（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同不同的限制与修饰体系的限制与修饰体系，则以罗马数字表示。因此，则以罗马数字表示。因此，流感嗜血菌流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别菌株的几个限制与修饰体系分别表示为表示为HindI、HindII、HindIII等等。等等。第二节第二节 核酸的酸碱性质核酸的酸碱性质 1碱基的解离碱基

11、的解离 核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解离，核酸的酸碱性质与此有关。离，核酸的酸碱性质与此有关。由于嘧啶和嘌由于嘧啶和嘌呤化合物杂环呤化合物杂环中的氮以及各中的氮以及各取代基具有结取代基具有结合和释放质子合和释放质子的能力，所以的能力，所以这些物质既有这些物质既有碱性解离又有碱性解离又有酸性解离的性酸性解离的性质。质。例如：胞嘧啶例如：胞嘧啶的解离的解离胞嘧啶环所含氮原子上有一对未共用电子，可与质子结合胞嘧啶环所含氮原子上有一对未共用电子，可与质子结合；此外，胞嘧啶上的烯醇式羟基与酚基很相像，具有释放质此外，胞嘧啶上的烯醇式羟基与酚基很相像，具有释放质子的能

12、力，呈酸性子的能力，呈酸性 例如：例如：腺嘌呤的解离腺嘌呤的解离2.核苷酸的解离核苷酸的解离 由于核苷酸含有磷酸与碱基，为两性电介由于核苷酸含有磷酸与碱基，为两性电介质，它们在不同质，它们在不同pH的溶液中解离程度不同，的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成在一定条件下可形成兼性离子兼性离子。带负电荷。带负电荷的磷酸基正好与带正电荷的含氮环数目相的磷酸基正好与带正电荷的含氮环数目相等，这时的等，这时的pH即为此即为此核苷酸的等电点核苷酸的等电点 pI=(pk1+pK2)/2 pK1值是由于第一磷酸基值是由于第一磷酸基-P03H2的解离，的解离，pK2是由于含氮环是由于含氮环N+H-的解离，的

13、解离，第三节第三节 核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有一的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。不附近。不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。分光光度计加以定量及定性测定。1.核酸样品纯度和含量的鉴定核酸样品纯度和含量的鉴定 从从A260A280的比值即可判断样品的纯的比值即可判断样品的纯度。度。纯纯DNA的的A 260A280应大于应大于1.8

14、，纯纯RNA的的A 260A280应达到应达到2.0 对于纯的样品，只要读出对于纯的样品，只要读出260nm的的A值即值即可算出含量。通常以可算出含量。通常以1A=50ugmL双螺双螺旋旋DNA或或40ugmL单链单链DNA(或或RNA)，或或20ugmL寡核苷酸计算寡核苷酸计算 对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经分离出区带后，经溴化乙锭溴化乙锭染色在紫外染色在紫外灯下粗略地估计其含量。灯下粗略地估计其含量。有时核酸溶液的紫外吸收以有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷吸光系摩尔磷吸光系数数来表示：来表示：(P)=A/c l 一般天然一般天然DNA的的

15、(P)为为6 600，RNA为为7 7007 800。单链多核苷酸的。单链多核苷酸的(P)(P)值比双螺旋结构多值比双螺旋结构多核苷酸的核苷酸的(P)(P)值要高。值要高。核酸发生变性时，核酸发生变性时，(P)(P)值升高，此现象称为值升高，此现象称为增色效应增色效应。（这是因为双螺旋结构使碱基对的。（这是因为双螺旋结构使碱基对的电子云发生重叠，因而减少了对紫外光的吸电子云发生重叠，因而减少了对紫外光的吸收）收）复性后复性后(P)(P)值又降低，这现象称值又降低，这现象称减色效应减色效应。测定核酸的测定核酸的(P)(P)可判断可判断DNADNA制剂是否发生变性制剂是否发生变性或降解。或降解。第

16、四节第四节 核酸的变性、复性及杂交核酸的变性、复性及杂交 一、核酸的变性一、核酸的变性(denaturation)变性变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的断裂。并不涉及共价键的断裂。1.引起核酸变性的因素引起核酸变性的因素 （1 1）温度；加热到）温度；加热到8080100 100 （2 2）酸碱度改变）酸碱度改变 （3）化学试剂：）化学试剂：尿素尿素、甲醛甲醛 2.核酸变性的核酸变性的特点特点（1 1）一系列物化性质也随之发生改变）一系列物化性质也随之发生改变：紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密度升高，

17、酸碱滴定曲线改变等度升高，酸碱滴定曲线改变等（2 2）变性作用发生在一个很窄的温度变性作用发生在一个很窄的温度范围内范围内。通常把加热变性使通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失的双螺旋结构失去一半时的温度称为该去一半时的温度称为该DNA的熔点的熔点或或熔熔解温度解温度，用，用Tm表示。表示。DNA的的Tm值一般值一般在在8295之间之间 3.影响影响TmTm值的因素值的因素 (1)DNA的的均一性均一性。越越均一，均一，DNA熔解温度发熔解温度发生在一个很生在一个很窄的温度范窄的温度范围之内围之内 (2)G-C之之含量含量。G-C对含量越多，对含量越多，TmTm值越高值越高 (3)介质中的离子

18、强度介质中的离子强度。一般说在较高的一般说在较高的离子强度时，离子强度时，DNA的的TmTm值较高，而且熔值较高，而且熔解过程发生在一个较小的温度范围之内。解过程发生在一个较小的温度范围之内。二、复性二、复性(renaturation)变性变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构，这过程称的链重新缔合成为双螺旋结构，这过程称复性复性 1.DNA复性的特点：复性的特点：（1 1）许多物化性质又得到恢复）许多物化性质又得到恢复 （2 2）将热变性的）将热变性的DNA骤然冷却时，骤然冷却时，DNA不可不可能复性能复性 （3）DNA的片段越大

19、，复性越慢。的片段越大，复性越慢。（4）DNA的浓度越大，复性越快。的浓度越大，复性越快。2.Cot l/2 衡量复性反应的速度快慢的指标衡量复性反应的速度快慢的指标 Co为变性为变性DNA复性时的初始浓度，以核复性时的初始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表示，苷酸的摩尔浓度表示，t为时间，以秒表示，为时间，以秒表示，Cot l/2表示复性一半的表示复性一半的Cot值值 在在DNA浓度相同的情况下，浓度相同的情况下，Cot l/2与基因组的大小成正比与基因组的大小成正比三、核酸的杂交三、核酸的杂交(hybridization)1.1.定义：定义：将将不同来源不同来源的的DNA放在试管里，经热变放在试管

20、里，经热变性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异源源DNA之间在某些区域有相同的序列，之间在某些区域有相同的序列，则复性时，会形成杂交则复性时，会形成杂交DNA分子。分子。DNA与互补的与互补的RNA之间也可以发生杂交。之间也可以发生杂交。是分子生物学和分子遗传学的研究中应是分子生物学和分子遗传学的研究中应用极广的技术。用极广的技术。2.2.常见杂交的类型常见杂交的类型（1）Southern blotting（2）Northern blotting （3）Western blotting（1）.Southern印迹杂交印迹杂交 将在电泳凝胶中分离的将在电泳凝胶中分

21、离的DNA片段片段转移并转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与标记结合在适当的滤膜上，然后通过与标记的单链的单链DNA或或RNA探针的杂交作用检测探针的杂交作用检测这些被转移的这些被转移的DNA片段片段 由于它是由由于它是由ESouthern于于1975年首先设年首先设计出来的，故叫做计出来的，故叫做Southern DNA印迹转印迹转移技术。移技术。（2）Northern blotting 1979年，发展出了一种新的方法，将年，发展出了一种新的方法，将RNA分子分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂

22、交的一种实验方法。由此可见行核酸杂交的一种实验方法。由此可见，这种方法同，这种方法同DNA印迹杂交技术十分类印迹杂交技术十分类似似 （3）Western blotting 将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种技术叫做技术叫做Western蛋白质杂交技术。蛋白质杂交技术。第第1515章章核酸的研究方法核酸的研究方法 制备天然核酸必需采用温和的条件，制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其防止过酸、过碱，避

23、免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分离、提纯和定量测定一、核酸的分离、提纯和定量测定真核真核DNADNA以核蛋白（以核蛋白（DNPDNP）形式存在，）形式存在，DNPDNP溶于水溶于水或高盐溶液（或高盐溶液（1mol/L NaCl1mol/L NaCl），但不溶于低盐），但不溶于低盐溶液（溶液（0.14mol/L NaCl0.14mol/L NaCl去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。DNADNA沉淀：沉淀：0.3M NaAC-70%0.3M NaAC-70%乙醇乙醇（一）（一）DNA分离纯化分离纯化制备制备RNARNA时

24、，最重要的是使时，最重要的是使RNaseRNase灭活：灭活：所有容器都要经过所有容器都要经过高温处理高温处理，不能高温高，不能高温高压的用压的用0.10.1焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPCDEPC）处理。处理。加入加入强变性剂强变性剂（如胍盐）使（如胍盐）使RNaseRNase失活；失活；在在RNARNA的反应体系内加入的反应体系内加入RNaseRNase的的抑制剂抑制剂（如（如RNasin)RNasin)（二）（二）RNA的分离的分离（三）核酸含量的测定（三）核酸含量的测定2、定糖法定糖法 RNA：核糖核糖 糠醛糠醛 绿色物质（绿色物质（670-680nm）DNA：脱氧核糖脱氧核糖+二

25、苯胺二苯胺兰色物质（兰色物质（595-620nm）苔黑酚/地衣酚浓HCl浓硫酸1、紫外吸收法紫外吸收法1个个A50g/ml 双链双链DNA 40g/ml RNA或单链或单链DNA3、定磷法定磷法 核酸含磷量为核酸含磷量为9.5%1g磷相当于磷相当于10.5g核酸核酸4、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭溴乙锭能插入能插入DNA分子的碱基分子的碱基对对间形成复合物间形成复合物在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与荧光强度与DNA含量成正比含量成正比纯纯DNA DNA 比值比值1.81.8，1.8 Pr1.8 Pr、苯酚污染、苯酚污染纯纯RNA RNA 比值

26、比值2.02.0，2.0 DNA 2.0 DNA、PrPr、苯酚污染、苯酚污染（四）、核酸纯度的测定OD260OD280二、核酸的沉降特性与超速离心二、核酸的沉降特性与超速离心 不同构象的核酸（线形、不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度离降速率不同，用密度梯度离心可以将不同构象心可以将不同构象DNADNA、RNARNA与蛋白质区分开来与蛋白质区分开来8M CsCl，45000rpm，16h密度梯度：密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml平衡时：浮力密度平衡时：浮力密度=CsCl密度密度=离心力离心力=0+4.22（r2-r02）10-

27、10：浮力密度：浮力密度：角速度（弧度：角速度（弧度/秒）秒）r：样品到转轴的距离：样品到转轴的距离（一）核酸密度的测定G-C含量与含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系的浮力密度之间呈正比关系=0.1 xG-C+1.658xG-C=（-1.658）10 （二）测定（二）测定DNADNA的的G-CG-C含量含量RNADNA变性变性DNA双链双链DNA 蛋白质，蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大变性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的构象（三）研究核酸的构象（四）用于核酸的制备（四）用于核酸的制备超螺旋超螺旋DNADNA或或用于大片段用于大片段DNA的分离，精度低，但的分离，精度低，但分离范围广

28、。分离范围广。三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳用于小片段用于小片段DNA的分析的分析相对分子质量小于相对分子质量小于1000bp1000bp的的DNADNA片断片断和和RNARNA的电泳。的电泳。PAGEPAGE中一般不含中一般不含RNaseRNase，用于，用于RNARNA分分析时不会分解样品。析时不会分解样品。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）（一）（一）DNADNA的酶法测定的酶法测定四、核酸的核苷酸序列测定四、核酸的核苷酸序列测定英国英国 SangerSanger1955 1955 确定牛胰岛素结构，确定牛胰

29、岛素结构，1958 1958 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖1975 1975 设计出设计出DNADNA测序法，测序法，1980 1980 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖合成一段与待测合成一段与待测DNADNA序列互补的序列互补的DNADNA片段群。片段群。末端终止法末端终止法Sanger22，33双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸（ddNTPddNTP）是）是DNADNA合成链延伸的合成链延伸的抑制抑制剂剂。MOV:MCB4.0Dideoxy sequencing of DNADNA序列分析仪：序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP（二）（二）DNADNA的化学法测序：的化学法测序：由由Maxam

30、Maxam和和GilbertGilbert所发明。所发明。其基本原理是用特异的其基本原理是用特异的化学试剂化学试剂作用于作用于DNADNA分子中的不同碱基，然后用分子中的不同碱基，然后用哌啶哌啶切断反应碱基切断反应碱基的多核苷酸链。用的多核苷酸链。用4 4组不同的特异反应，可使末组不同的特异反应，可使末端标记的端标记的DNADNA分子切成不同长度的片断，其末端分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱影得到测序图谱 4 4组特异的反应如下：组特异的反应如下：（1 1）G G反应：反应：用硫酸二甲酯用硫酸二甲酯DM

31、SDMS使鸟嘌呤上的使鸟嘌呤上的N N7 7原子甲原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断裂裂（2 2）G+AG+A反应：反应：用甲酸使用甲酸使A A和和G G嘌呤环上的嘌呤环上的N N原子质子化，原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂（3 3）T+CT+C反应：反应：用肼使用肼使T T和和C C的嘧啶环断裂，再用哌啶的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基除去碱基（4 4）C C反应：反应：当有盐存在时，只有当有盐存在时，只有C C与肼反应，并被哌与肼反应，并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱

32、落，并使去掉碱基的磷酸啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂二酯键断裂 32P-GCTACGTA：在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处：32p，32p-GCTAC在C处：32P-G和 32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-GCTACG硫酸二甲酯（G）：*ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（G+A）：*A*ACTTCG*ACTTCGA*ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼/Nacl（C）：*AC *ACTTC*ACTTCGA C*ACTTCGACAG 肼（C+T）：*AC *ACT *ACT T*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACA

33、G从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。32P*ACTTCGACAG（三）（三）RNARNA的测序的测序 RNARNA的测序方法有的测序方法有3 3个：个：（1 1）用酶特异切断）用酶特异切断RNARNA链：链：（2 2）用化学试剂裂解）用化学试剂裂解RNARNA（3 3）逆转录成）逆转录成cDNAcDNA19951995年年K.MullisK.Mullis发明。基本步骤为：发明。基本步骤为：1.1.设计一对引物以便有效扩增所需要的设计一对引物以便有效扩增所需要的DNADNA序列，并尽量减少可能产生的非特异产物序列，并尽量减少可能产生的非特异产物2.2.优化反应体系：包括适量模板、引物、

34、优化反应体系：包括适量模板、引物、4 4种种dNTPdNTP、Taq DNATaq DNA聚合酶和适量聚合酶和适量MgMg2+2+五、五、DNADNA聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR）3.3.选择选择3 3个温度进行热循环：个温度进行热循环：变性变性9494，454560s60s；退火，根据引物的退火，根据引物的Tm Tm，1min1min；延伸，延伸，7272，1min1min。循环循环4.4.扩增完成后取出一定量的反应产物，检扩增完成后取出一定量的反应产物，检测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙啶染色，紫外光下检测结果啶染色，紫外光下检测结果

35、y=产物；产物；x=扩增效率；扩增效率；n循环次数循环次数(1)nyx 如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。数量满足实验需求为止。模板模板DNA（单链）（单链）引物引物DNA聚合酶（聚合酶（Taq）dNTPMg2+MOV:MCB4.0POLYMERASE CHAIN REACTION六、六、DNA的化学合成的化学合成P521P521图图15-615-6固相合成法（亚磷酸三酯法）合成固相合成法（亚磷酸三酯法）合成DNADNA合成方向：合成方向：3 53 5端端5-OH5-OH用二对甲氧三苯甲基（用二对甲氧三苯甲基（DMTDMT）保护。）保护。3-OH3-OH用氨基亚磷酸化合物活化用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护碱基上氨基用苯甲酸保护