分子生物学研究法课件.ppt
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- 分子生物学 研究 课件
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1、分子生物学研究法n一一.重组重组DNA技术概论技术概论n二二.常见的常见的DNA操作技术操作技术n三三.基因克隆技术基因克隆技术(狭义狭义)n四四.基因表达研究技术基因表达研究技术n五五.基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析n六六.蛋白质组学及其研究技术蛋白质组学及其研究技术一一.重重组组DNA技技术术概概论论 二.常见的DNA操作技术n2.1 琼脂糖凝胶电泳n2.2 SDS-PAGE 电泳n2.3 PCR技术n2.4 测序技术n2.5 杂交技术n2.6 ELISA 技术n2.7 细菌转化n2.8 cDNA文库n2.9 SNP技术及应用n2.10 基因打靶琼脂糖凝胶电泳n1、原理:、原理:n2
2、、用途:、用途:n3、技术要点、技术要点琼脂糖凝胶电泳的原理 1.DNA电泳迁移:电荷效应分子筛效益 (1)DNA带负电,电场中,向正极移动;(2)决定移动速度三因素:DNA大小,电荷数,构型;(3)线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成反比;(分子量越大,跑得越慢)2、检测原理:(1)溴化乙锭(EB)可插入双链DNA分子中,在紫外光照射下,发射荧光。琼脂糖凝胶电泳用途n1.DNA分子量测定(距离分子量)n2.基因,克隆的鉴定(通过1完成)n3、不同长度的基因片断的分离n4、DNA浓度的测定 (荧光的强度与DNA含量成正比)*也可用于蛋白的分离鉴定n加标准分子量DNA Marker,测定分
3、子量n加标准浓度的DNA,测定浓度琼脂糖凝胶电泳技术要点n1.不同浓度凝胶分辨DNA片段能力不一样(p33)(1)低:不利于小片段的分辨(扩散)(2)高:不利于大片段的分辨(迁移不动)(3)一般选1.0%n2.凝胶要用缓冲液配(TBE 或 TAE)n3.EB强致癌,带手套操作;n4.agarose(琼脂糖)电泳 agar(含琼脂糖和琼脂胶)平板培养基SDS-PAGE 电泳1、原理2、用途3、技术要点SDS-PAGE 电泳原理n1.SDS(带负电)和还原剂破坏蛋白的高级结构,同时SDS与蛋白定量结合,消除蛋白之间的电荷差异,使得蛋白的迁移率主要依赖分子量蛋白的迁移率主要依赖分子量 (分分子小跑得
4、快子小跑得快).).n2.2.不连续电泳不连续电泳:上层为浓缩胶上层为浓缩胶,可将样品压缩到可将样品压缩到同一起跑线同一起跑线,下层为分离胶下层为分离胶;可获得更高的分可获得更高的分辨率辨率.n3.3.考马斯亮蓝进行染色考马斯亮蓝进行染色.SDS-PAGE 电泳用途n1.蛋白分子量的测定n2.蛋白浓度的测定n3.蛋白的鉴定(通过1来实现)SDS-PAGE 技术要点n1.浓缩胶一般用5%,分离胶:次高分子(10万-20 万)用7%,低分子(1.4万10万)用122、PAGE配制时带手套,(Acr-Bis液体有积累性神经毒,聚合后无毒)3.SDSPAGE测定的是单体蛋白分子量;(多亚基不行)4、S
5、DSPAGE不适于:(1)电荷异常蛋白:组蛋白(电多)(2)构象异常的 蛋白 (3)带有较大辅基的蛋白糖蛋白,脂蛋白。PCR技术n1、原理n2、应用n3、技术要点PCR技术原理 5 3 3 5 循环过程(32 次左右)1.解链:94,30 s2.引物结合:?,30 s3.延伸:72,?Min 特点1.引物两条,以2n指数扩增(前20-25次),后面扩增效率降低,30次以后,基本进入平台期。2.引物结合温度?一般为50-55,需要调整;3.延伸时间?Min需要调整,一般1kb/min.PCR技术应用n1.基因检测;n2.基因的制备(包括基因的修饰)PCR技术操作要点n1.灵敏度高,防止污染,出现
6、假阳性(带手套,设立阴性,阳性对照);n2.需要摸索结合温度,提高扩增的特异性。杂交技术n1.Southern blot-检测DNAn2.Northern blot-检测RNAn3.Western blot-检测蛋白Southern blot,Northern blot和Western blot 比较名称名称检测对象检测对象探针探针检测原理检测原理处理过程处理过程用途用途Southern blotDNA标记单链核酸核酸复性中碱基配对专一性琼脂糖电泳后转膜基因检测(拷贝数)Northern blotRNA标记单链核酸核酸复性中碱基配对专一性变性琼脂糖电泳后转膜基因表达的检测(表达量)Wester
7、n blot蛋白抗体抗原抗体特异性结合SDS-PAGE后转膜基因表达产物蛋白的检测ELISA 原理和用途类似于Western blot,但在酶标板中操作,无需SDS-PAGE转膜,操作简单,可批量检测,并可半定量测定。Southern blotNorthern blotWestern blot双脱氧法测序(Dudeoxy sequence analyses)双脱氧法又称末端终止法,用于单链测序1.原理:Atkinson发现用 DNA pol 合成DNA时如在反 应物中加入一定量的 2,3ddTTP 时,因ddT 的3碳原子不含OH,故DNA不能延伸。1982年Sanger 利用此原理建立了双脱
8、氧测序法。原理和加减法相似,但不再是加一种dNTP或减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷,来终止聚合反应。用此法测得G4含5577bp.2.1 细菌转化n通常情况下,外源基因无法进入细菌细胞内;n当用电击法,或CaCl2,或RuCl等方法处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源基因进入的感受态细胞。n感受态细胞的活性较低,处理需温柔。2.2 PCR(聚合酶链式反应)技术 5 3 3 5 PCR的基本原理的基本原理变性、复性、半保留复制变性、复性、半保留复制 PCR三步曲三步曲n变性变性 9097n退火退火 4555n延伸延伸 72变性延伸退火90 9540 6070 75PCR2.3
9、 cDNA文库一.cDNA:二.(1)将mRNA反转录为双链DNA.(2)特点:A.稳定;B.无内含子.二.cDNA文库:(1)代表了生物体某一器官或者组织mRNA中所含的全部或绝大部分遗传信息.(2)特点:A.不同的生物,同一生物不同组织,同一组织不同发育时间或不同生理状态下,cDNA文库不同;B.建好的cDNA文库的具体的信息未知,仅提供吊取相关目的基因的材料.C.每个克隆不一定是全长基因cDNA文库建库过程n1.高质量mRNA的制备;n2.反转录生成cDNAn3.与载体分子连接(噬菌体文库)n4.转染(噬菌体的包装)说明说明:1.引物引物 oligo dT,随机引物随机引物R62.(得到
10、全长得到全长cDNA)2.两端可加上酶切接头两端可加上酶切接头,便于克便于克隆到载体上隆到载体上.3.合成时合成时,原料用甲基化的原料用甲基化的dCTP.防止酶切时损伤内部序列防止酶切时损伤内部序列.4.转化效率要高转化效率要高,防止少量表达防止少量表达的的mRNA未得到克隆未得到克隆.2.4 SNP技术及应用nSingle nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性 (标记)n是指同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化,主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性。n用途:(1)遗传的分子标记-物种鉴定 (2)生物功能异常的基因标记-疾病的检测;Si
11、ngle nucleotide polymorphismSNP的特征 nSNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种,占所有已知多态性的90%以上,在人类基因组中广泛存在,大约平均1000个碱基对就会出现一个SNP,估计整个人类基因组30亿碱基中至少有300万个SNP。nSNP大都表现为二等位基因(bialletic)多态性,即在该位置只存在两种不同的碱基。nSNP作为一种碱基的替换,大多数为转换(CT,GA),也可能是颠换。转换的发生率总是明显高于其它几种变异,而且在CG序列上出现最为频繁,多是发生CT的转换,原因是CG中的C是甲基化的,它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧啶。SNP的检测方法 n单链
12、构象多态性单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism,SSCP)原理:单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列决定的,当某一个碱基发生突变时,便会直接影响该链的构象,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移率会发生改变。n变性梯度凝胶电泳(变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)原理:当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时,DNA发生部分解链,电泳迁移率下降,DNA链中有一个碱基改变时,会在不同的时间发生解链,因影响电泳速度变化的程度而被分离。荧光共振能量传
13、递(fluorescent resonance energy transfer,FRET)供者受者 探针探针53Taqman法法分子信标分子信标(molecular beacon)法法 n高效液相色谱n-质谱分析法质谱分析法nDNA芯片技术(芯片技术(DNA chip)SNP数据库 n美国国立生物技术信息中心 http:/www.nchi.nlm.nin.gov/snpn德国的HGBAS网站 n http:/www.hgbas.cgr.ki.sein日本JST的数据库 n http:/snp.ims.u-tolkyo.ac.jp2.5基因打靶(gene targeting)n通过DNA定点同源
14、重组,改变基因组中的某一特定基因,在生物活体内研究该基因的功能。(反向遗传学)n基因敲除(gene knockout):定向敲除n基因敲入(gene knockin):定向替代基因打靶的必备条件n胚胎干细胞(ES细胞)n能在体外培养,保留发育的全能性n打靶载体nNeo(新霉素)阳性筛选标志nHSV-tk阴性筛选标志:单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)基因敲除的基本程序n打靶载体的构建n打靶载体导入ES细胞:重组置换n基因敲除ES细胞注射入胚泡n胚泡植入假孕小鼠的子宫中n嵌合体的杂交育种基因敲除 Knockoutn1.完全基因
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