KJ02食品微生物检验方法课件.ppt

1、l菌落总数检测l大肠菌群及大肠杆菌检测l金黄色葡萄球菌检测l沙门氏菌检测l单核细胞增生李斯特氏菌检测l菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。l判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。l及时反映食品加工过程是否符合 卫生要求，为被检食品卫生学评 价提供依据。l通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越 大，菌落总数的多少在一定程度 上标志着食品卫生质量的优劣。检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）适当十倍稀释样品选择23个连续适宜稀释度各取1mL分别加入灭菌平皿内（每个稀释度做

2、两个平行）每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）35 ，48 2h菌落计数 l选择25250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：N=C/（1*n1+0.1*n2）*dl所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为25*1/d。EAPC：estimated aerobic plate countl所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。l所有平板的菌落数都超过100/cm2，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积

3、作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为65*100*1/d。l无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。l最终结果保留前两位有效数字。按照4舍6入，5是奇进偶不进。检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）适当十倍稀释样品选择23个连续适宜稀释度各取1mL分别加入灭菌平皿内（每个稀释度做两个平行）每皿内加入适量（1215mL）平板计数琼脂（PCA），301 ，72 3 h菌落计数 如果怀疑样品中含有如果怀疑样品中含有在培养基表面蔓延生在培养基表面蔓延生长的菌落，待琼脂凝长的菌落，待琼脂凝固后，在其上覆盖一固后，在其上覆盖一层（层（4mL4mL）水琼脂

4、。水琼脂。平板叠放不超过6个l选择连续2个稀释度不超过300CFU的平板，且一个平板至少含15CFU进行计数，计算公式如下：N=C/（n1+0.1*n2）*dl所有平板的菌落数都不足15CFU，计算2平板菌落的算术平均值m，液体样品：NE=m 固体样品：NE=md-1l无菌生长：液体样品：less than 1;固体样品：less than 1 d-1l最终结果保留前两位有效数字。l由于检样中采用30/35有氧条件下培养，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。l鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式

5、存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colony forming units，CFU）报告。l每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过15min，主要为防止细菌增殖和产生片状菌落。样液与琼脂应充分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。l检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间

6、相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。l检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4 放置，以便在计数检样时用作对照。l大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。l大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。l大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌

7、），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。l大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为+-或-+-的细菌。l与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。l大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。l食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对

8、人体健康危害性的大小。l大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。基本形态：此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。培养特性：l大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖

9、的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37，在42-44 条件下仍能生长，生长温度范围15-46。l 在普通营养琼脂上有3中菌落形态：1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝；3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。检样50g+450ml稀释液 适当十倍稀释样品选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL 35，24 2h 48 2h 没有产气管 有产气管 报告阴性 接种BGLB肉汤管 接种EC肉汤 35 ，48 2h 44.50.5

10、 （水浴培养）24 2h 48 2h 查MPN表报告结果 产气管接种EMB平板（35、1824h）（大肠菌群）从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜 面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接 种LST复检产气 查MPN表报告结果（大肠杆菌）lMPNMPN检索表：检索表：MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。l初发酵和证实试验：初发酵和证实试验：1）两步

11、法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37分解乳糖产酸产气”。LST中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖肉汤允许“缓慢乳糖发酵（Slow lactose fermentations）”来促进菌体产气。BGLB中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。

12、l产气量与倒管：产气量与倒管：在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。EMB平板典型大肠杆菌菌落特征：中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽lEMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；l高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫

13、色，倾注平板前应先摇匀；l大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；l该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件。菌名菌落形态大肠埃希氏菌 紫黑色，有绿色金属光泽肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深阴沟肠杆菌粉色，中心色深弗氏志贺氏菌无色鼠伤寒沙门氏菌 无色粪链球菌无色基本原理：革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。此法可将细菌分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌两大类。革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少。当用酒精或丙酮酸脱色时，类脂质被溶解

14、，增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色。而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。Gram negativeGram positiveGram straining基本步骤：l将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；l滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；l滴加95%乙醇脱色约1530s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；l滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。l结果：革兰氏阳性菌呈，革兰氏阴性菌呈。T

15、estpositivenegativebiotype1 biotype2reagentIndole红色环不变色+-KovacsMR红色不变色+甲基红V-P玫瑰红色环不变色-V-P甲、乙液Citrate生长不生长-I M Vi C生化试验生化试验l根据根据伯杰氏鉴定细菌学手册伯杰氏鉴定细菌学手册，按葡萄，按葡萄球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌黄色葡萄球菌(Staphylococcus Staphylococcus aureusaureus)、表皮葡萄球菌表皮葡萄球菌(S.S.epidermidisepidermidis)和腐生葡和腐生葡萄球菌萄

16、球菌(S.S.saprophyticussaprophyticus)，其中金葡多其中金葡多为致病性菌，表葡偶尔致病。为致病性菌，表葡偶尔致病。l金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染中最常金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染中最常见的病原菌。可引起局部化脓性感染，如见的病原菌。可引起局部化脓性感染，如疖、痈、皮下脓肿、外科切口及烧伤创面疖、痈、皮下脓肿、外科切口及烧伤创面的感染；也可引起肺炎、伪膜性肠炎、肾的感染；也可引起肺炎、伪膜性肠炎、肾盂肾炎、心包炎等多系统的化脓性感染；盂肾炎、心包炎等多系统的化脓性感染；还可引起败血症、脓毒症等全身性感染。还可引起败血症、脓毒症等全身性感染。葡萄球菌的致病力强弱主要

17、取决于其产生葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶。的毒素和侵袭性酶。金黄色葡萄球菌呈球形，直金黄色葡萄球菌呈球形，直径径0.8m0.8m左右，排列成葡萄左右，排列成葡萄串状串状 ，无芽孢，无荚膜。，无芽孢，无荚膜。革兰氏染色阳性，但衰老、革兰氏染色阳性，但衰老、死亡或被白细胞吞噬的菌体，死亡或被白细胞吞噬的菌体，常呈革兰氏阴性。常呈革兰氏阴性。l金黄色葡萄球菌在肉汤中呈浑浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时金黄色葡萄球菌在肉汤中呈浑浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈浑浊生长。液体澄清，菌量多时呈浑浊生长。l血平板上金黄色葡萄球菌呈金血平板上金黄色葡萄球菌呈金黄色，有时

18、也为白色，大而突黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。周围有溶血圈。lBaird-ParkerBaird-Parker平板上金黄色葡萄平板上金黄色葡萄球菌圆形突起、光滑、湿润球菌圆形突起、光滑、湿润，颜颜色呈灰色到黑色，边缘淡色，周色呈灰色到黑色，边缘淡色，周围为一浑浊带，在其外层有一透围为一浑浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度。油树胶的硬度。lMPNMPN法：适用于检测带有大量竞争菌的法：适用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的含少量金食品及其原料和未经处理的含少量金黄色

19、葡萄球菌的食品。黄色葡萄球菌的食品。l直接平板计数法：适用于检查金黄色直接平板计数法：适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于葡萄球菌数不小于10/g10/g（mlml）的食品。的食品。l增菌培养法：适用于检查含有受损伤增菌培养法：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。的金黄色葡萄球菌的加工食品。定量方法定量方法定性方法定性方法 检样（50g+450mL稀释液）适当十倍稀释样品 选择23个连续适宜稀释度 吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分别涂布于 3块90mmBaird-Parker平板上（做平行试验）35，4548 h 确证试验 报告或涂布于1块140mm平板上 检样（

20、50g+450mL稀释液）适当十倍稀释样品 选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管10%NaCl TSB肉汤肉汤，每管接种1mL 35，48 2 h 从生长的管中接种1环划线于 Baird-Parker平板上 35，48 h 确证试验 报告含1%丙酮酸钠1.凝固酶试验凝固酶试验l方法：方法：从平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落，移种到TSB/BHI肉汤中，置35培养18-24h。取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆充分混合，置35培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察6h。试验中需同时做已知阳性和阴性对照。试验中需同时做已知阳性和阴性对照。l结果判定：结果

21、判定：以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动为阳性。部分凝固（2+和3+）的必须进行生化鉴定加以证实。2.革兰氏染色革兰氏染色l对所有的可疑培养物都要进行革兰氏染色。对所有的可疑培养物都要进行革兰氏染色。3.3.生化鉴定生化鉴定l过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验l葡萄糖厌氧利用试验葡萄糖厌氧利用试验l甘露醇厌氧利用试验甘露醇厌氧利用试验l金葡溶菌酶敏感性试验金葡溶菌酶敏感性试验l耐热核酸酶试验（辅助）耐热核酸酶试验（辅助）Staphylococcus aureus on DNase Agar特性S.aureusS.epidermidisMicrococci过氧化氢酶+凝固酶+-耐热核酸酶+-溶

22、菌酶+-厌氧利用葡萄糖+-甘露醇+-检样（xg+9xmL稀释液）适当十倍稀释样品 选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管modified Giolitti and Cantoni broth，37，2448 h 从变黑或出现黑色沉淀的管中 接种1环培养物于 Baird-Parker平板上 37，48 h 确证试验 报告接种接种10mL 10mL 于于10mL10mL双料肉汤，双料肉汤，接种接种1mL 1mL 于于9mL9mL单料肉汤。单料肉汤。小心的于接小心的于接种管中培养种管中培养基顶部倾注基顶部倾注一定量的水一定量的水琼脂，使其琼脂，使其凝固形成密凝固形成密封塞。封塞。凝

23、固酶试验凝固酶试验l结果判定：结果判定：-1+2+3+4+negative positivel1880年E.Berth首先发现伤寒沙门氏菌，1885年Salmon与Smith又分离出猪霍乱沙门氏菌，以后取Salmon氏之名为本菌属之名。l沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2000多个血清型，我国已发现血清型近200个。形态特征：革兰氏阴性，大小为130.40.9m的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。培养特性：l沙门氏菌需氧或兼性厌氧，10-42 都可生

24、长，最适生长温度为37，最适pH为6.87.8。l营养琼脂平板上：3537培养1824h，其菌落大小一般为23mm，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。l血平板上：中等大小的灰白色菌落。生化特性：l绝大多数沙门氏菌有规律的发酵葡萄糖产酸产气，但也有不产气者，不发酵蔗糖和侧金盏花醇、不产生吲哚、不分解尿素。l菌体抗原（O抗原）l表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原l鞭毛抗原（H抗原）l纤毛抗原前增菌 25g样+225mL乳糖肉汤（肉制品、肉副产品、动物产品）匀质2min，室温放置60 5min 混合均匀，测定调节PH6.8 0.2 35、24 2h选择性增菌 0.1ml+10mlMM（RV）1m

25、l+10mlTTB 42、24h （水浴培养）35、24h 43、24h（水浴培养）含菌量高 含菌量低分离培养 划线接种 选择性培养基（BS、XLD、HE）35、2448h（BS）生化鉴定 每个平板挑取至少2个可疑菌（包括典型和非典型各2个）接种TSI三糖铁、LIA赖氨酸铁高层斜面（LIA高层深4cm）（松盖以保持有氧条件防止产生过多H2S）35、242h 弃去 尿素酶试验 卫矛醇、氰化钾、丙二酸钠、吲哚试验 阳性 阴性血清学 血清学试验沙门氏菌的分类 报告结果生鲜食物、严重污染的食品和动物饲料前增菌 25g样+225mLBPW 匀质 371、18 2h选择性增菌 0.1ml+10mlRVS

26、1ml+10mlMKTTn 41.5 1、24 3h 37 1、24 3h （水浴培养）分离培养 划线接种选择性培养基（XLD和第二种选择性培养基，如 BS）37、2448h（BS）每个平板挑取至少5个可疑菌进行纯培养和确认试验 37、243h 生化鉴定 TSI、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、-牛乳糖、V-P、吲哚试验血清学 血清学试验沙门氏菌的分类 报告结果试验沙门氏菌属伤寒A型副伤寒B型副伤寒C型副伤寒其他菌属反应%b反应%b反应%c反应%c反应%bTSI葡萄糖产酸+100+100+100TSI葡萄糖产气-d0+100+92TSI乳糖产酸-2-100-1TSI蔗糖产酸-0-0-1TSI硫化氢产生+

27、97-10+92尿素水解赖氨酸脱羧酶+98-0+95-牛乳糖反应-0-0-2eV-P反应-0-0-0吲哚反应-0-0-1b：百分率表明并不是所有分离到的沙门氏菌血清型都会显示+或-的结果。c：这些百分率不能从现有的文献中获得。d：伤寒沙门氏菌不产气e：亚利桑那亚型肠炎沙门氏菌为乳糖阳性或阴性反应，但通常-牛乳糖反应阳性。XLD琼脂：FDA BAM典型菌落：粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈 现大的具光泽的黑色中心或几乎为全部黑色的菌落。非典型菌落：黄色带或不带黑色中心。ISO中心黑色、周围由于指示剂颜色的改变而出现红色的轻微透明带。菌名菌落形态鼠伤寒沙门氏菌 红色，有黑心伤寒沙

28、门氏菌红色，有黑心弗氏志贺氏菌红色大肠埃希氏菌 黄色，有胆盐沉淀环粪链球菌-BS琼脂：FDA BAM典型菌落：产硫化氢菌落黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周 围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而 变为黑色，并有晕环效应；非典型菌落：有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色菌落，周围培养 基不变色。菌名菌落形态伤寒沙门氏菌 黑色，有金属光泽鼠伤寒沙门氏菌 黑色，有金属光泽奇异变形杆菌褐色或呈黑色，无金属光泽弗氏志贺氏菌棕色至绿色大肠埃希氏菌 棕色至绿色粪链球菌-50071 44104Blank 50115HE琼脂：FDA BAM典型菌落：兰绿色至兰色，多数菌株产硫化氢，菌落带或不带黑色 中

29、心或几乎全黑色。非典型菌落：乳糖阳性的菌株为黄色中心黑色或全黑色。菌名菌落形态伤寒沙门氏菌 蓝绿色，部分有黑心鼠伤寒沙门氏菌 蓝绿色，部分有黑心奇异变形杆菌蓝绿色，有或无黑心弗氏志贺氏菌蓝绿色大肠埃希氏菌 橙红色，有胆酸盐沉淀粪链球菌-TSI：典型反应：斜面产碱（K）：红色；底部产酸（A）：黄色；产H2S：黑色（少数不产）菌名生化反应肠炎沙门氏菌 K/A，产气，产H2S大肠埃希氏菌A/A，产气铜绿假单胞菌 K/K奇异变形杆菌K/A，产H2S弗氏柠檬酸杆菌A/A，产H2S弗氏志贺氏菌K/Al冷冻样品解冻需在冷冻样品解冻需在4545以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断以下，有自动调温器自控的水浴锅

30、内不断搅拌进行搅拌进行15min15min或在或在2-82-8，1818小时内软化。小时内软化。为保证检验的准确性，必须在选择性培养基上挑取足为保证检验的准确性，必须在选择性培养基上挑取足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。l进行生化反应时，应以纯培养物进行试验，如出现血清学阳性，进行生化反应时，应以纯培养物进行试验，如出现血清学阳性，而生化反应特征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培而生化反应特征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行生化试验。养物重新进行生化试验。测试中应同时接种阳性对照菌株。测试中应同时接种阳性对照菌株。l伯杰氏鉴定细

31、菌学手册第9版中，李斯特菌属有7个种：单核细胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes）、英诺克李斯特氏菌（L.innocua）、西尔李斯特氏菌（L.seeligeri）、威尔斯李斯特氏菌（L.welshimeri）、绵羊李斯特氏菌（L.ivanovvi）、格氏李斯特氏菌（L.grayi）、默氏李斯特氏菌（L.murrayi）。l单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起动物的感染，也可引起人的感染。形态特征：革兰氏阳性短杆菌，大小为0.40.50.52m，两端钝圆，常两两相串成弯曲及V形，偶尔有球状、双球状、短链状，但很少有长链状，兼性厌氧、无芽孢，一般不形成荚膜。该菌有4根

32、周毛和1根端毛，周毛易脱落。20培养后可见到很多鞭毛。培养特性：l生长温度为242（冷藏不能阻止该菌的生长），最适生长温度为3537。2025 培养有动力，37 培养动力消失；在显微镜下观察该菌新鲜的室温肉汤培养物可见翻筋斗运动。l在pH3.84.4仍能生长，在pH中性至弱碱性（9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在6.5%NaCl肉汤中也能良好生长。l血平板上：菌落通常不大呈灰白色，刺种血平板可产生窄小的溶血环。检样25g增菌 EB增菌液基础225mL 30 4h 加入抑菌剂 30 20h 30 44h 选择性分离培养 接种OXA和 PALCAM 接种OXA和 PAL

33、CAM 35 24-48h 35 24-48h 生化鉴定 TSA-YE纯培养 30 24-48h 典型运动 TSB-YE 过氧化氢酶试验 革兰氏染色 溶血试验 麦芽糖葡萄糖硝酸盐还原试验甘露醇七叶苷鼠李糖木糖SIM动力培养培养24h培养培养48h测试样品（x g或x mL）+9x mL一次增菌培养基（Half Fraser肉汤）30培养242h1mL培养液加入 划线接种Oxford琼脂 10mL二次增菌培养基中 和PALCAM琼脂 （Fraser肉汤）35或37培养482h 30、35或 划线接种Oxford琼脂 37培养24-48h 和PALCAM琼脂 30、35或37培养24-48h 李斯

34、特菌属的确证：-挑取可疑菌接种TSAYE培养基 -过氧化氢酶试验 -革兰氏染色 -动力试验 单核细胞增生李斯特菌的确证：-溶血试验 -碳源利用试验 -CAMP（协同溶血）试验 OXA琼脂lFDA：灰黑色菌落，周围有黑色环。lISO：生长在牛津琼脂上24h的典型李 斯特氏菌呈小（1mm）、灰色的菌落 外围是黑色的晕轮；48h后菌落变暗，可能见到绿色的辉光，直径约2mm。有黑色的晕轮并且中间凹陷。lOxford 琼脂平板培养于30适合于仅受额外菌群轻度污染的食品，对于受额外菌群重度污染的食品，最好培养于35或37，因为李斯特氏菌趋于和额外菌群一同生长。PALCAM琼脂菌名生长情况菌落形态及培养基变

35、化大肠杆菌完全抑制培养基颜色无变化金黄色葡萄球菌部分抑制菌落及其周围培养基变黄粪链球菌完全抑制培养基颜色无变化英诺克李斯特氏菌生长良好灰绿色菌落，周围培养基变黑绵羊李斯特氏菌生长良好灰绿色菌落，周围培养基变黑单增李斯特氏菌生长良好灰绿色菌落，周围培养基变黑ISO：对于微需氧培养的平板，培养后将平板暴露在空气中1h，使得培养基重新恢复其品红至紫色。经过24h培养后，李斯特氏菌呈小或细小的灰绿色或橄榄绿色菌落，有时中心黑色，但常常带有黑色的晕圈。48h培养后，呈现直径1.5至2.0mm的绿色菌落，中心下陷并围有黑色的晕圈。伞状动力伞状动力l挑取TSBYE肉汤培养物穿刺接种SIM或半固体动力培养基试

36、管试管，25培养5-7d。l李氏菌有动力、呈现典型的伞状生长伞状生长。典型运动典型运动l挑取25培养的TSAYE平板上的菌落，制备水浸片，显微镜下观察 李氏菌的翻滚、旋转运动。过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验l李氏菌过氧化氢酶阳性l制备57%羊血琼脂平板。l挑取TSAYE平板上的典型菌落刺种血平板，刺种时避免接触到平板底部和使琼脂破裂，同时接种阳性（单核细胞增生李斯特氏菌）和阴性（英诺克李斯特氏菌）对照。l单增呈现狭窄、清晰、明亮的-溶血；l西尔李氏菌出现弱的溶血现象；l绵羊李氏菌通常呈宽的、轮廓清晰的-溶血；l英诺克李氏菌不产生溶血现象。l方法：在羊血琼脂平板上平行接种-溶血金黄色葡萄球菌（S.

37、aureus）和马红球菌(R.equi),在它们中间垂直划线接种可疑菌，与两线相近但不相交，在30培养24h-48h,检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。l结果：靠近金黄色葡萄球菌接种点的单增李斯特氏菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，绵羊李斯特氏菌在马红血球附近的溶血增强。S.aureusR.equiL.monocytogenesL.innocuaL.ivanovviNarrow band-haemolysisNo haemolysisWide band-haemolysis 种别溶血性产酸CAMP试验鼠李糖木糖金黄色葡萄球菌 马红球菌L.monocytogenesL.innocuaL

38、.ivanovviL.seeligeriL.welshimeriL.grayiL.murrayi+-+(+)-+v-v-v-+-+-(+)-+-v:vatiable reaction(+):weak reaction+:90%of positive reaction-:no reaction 种别溶血性毒力a糖发酵c甘露醇鼠李糖木糖L.monocytogenesL.ivanovvi L.innocua L.welshimeriL.seeligeriL.grayiL.murrayi b+-+-+-+-vv-vv-+-+-a:mouse testv:variable biotypesb:硝酸盐还原

39、试验阳性，其它种该反应为阴性。c:葡萄糖、麦芽糖、七叶苷糖发酵试验全部为阳性。储备液的制备：称取储备液的制备：称取34g34g磷酸二氢钾溶解于磷酸二氢钾溶解于500ml500ml蒸馏水中，用蒸馏水中，用1NNaOH1NNaOH 溶液调整溶液调整pHpH值为值为7.27.2，再用蒸馏水稀释至，再用蒸馏水稀释至1000ml1000ml，121121高压灭菌高压灭菌15min15min，于冰箱中储存。于冰箱中储存。稀释液的制备：取稀释液的制备：取1.25ml1.25ml储备液，用蒸馏水稀释至储备液，用蒸馏水稀释至1000ml1000ml，定量分装，定量分装，121121高压灭菌高压灭菌15min15min备用。备用。称取称取8.5gNaCl8.5gNaCl溶解于溶解于1000ml1000ml蒸馏水中，定量分装，蒸馏水中，定量分装，121121高压灭菌高压灭菌 15min15min备用。备用。称取称取1g1g蛋白胨溶解于蛋白胨溶解于1000ml1000ml蒸馏水中，定量分装，蒸馏水中，定量分装，121121高压灭菌高压灭菌 15min15min备用。蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释备用。蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释 过程中使检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。过程中使检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。